滅幽湯對幽門螺桿菌相關性胃炎小鼠胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的影響

王小娟，尹 姣，郭建生，喻 斌*，杜中華，羅 燕，夏 蓉

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

滅幽湯對幽門螺桿菌相關性胃炎小鼠胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的影響

王小娟1，尹 姣2，郭建生2，喻 斌2*，杜中華2，羅 燕2，夏 蓉2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的 探討滅幽湯對幽門螺桿菌相關性胃炎（HAG）小鼠胃黏膜組織Toll樣受體2（TLR2）、核轉因子p65（NF-κBp65）的影響。方法 將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、模型組、胃三聯組、滅幽湯組。采用復合因素（肥甘食物+濕熱環境+幽門螺桿菌）建立BALB/c小鼠HP相關性胃炎脾胃濕熱證模型。采用免疫組化法檢測胃黏膜組織TLR2、NF-κBp65的蛋白表達情況。結果 小鼠模型組與正常對照組比較TLR2與NF-κBp65表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，滅幽湯組小鼠胃黏膜TLR2與NF-κBp65表達均降低(P＜0.05)。結論 滅幽湯能根除HP，可減輕HP引起的胃黏膜炎癥反應。其機制可能是通過下調TLR2，抑制NF-κBp65的激活，從而阻止NF－κB的活化，減輕胃粘膜炎癥反應，進而發揮其治療作用。

幽門螺桿菌；胃炎；滅幽湯；Toll樣受體2；核轉因子p65

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)是一種革蘭氏陰性細菌，寄居于人的胃黏膜中。作為一種環境致病因素，HP感染是引起胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要因素，對人類健康構成嚴重危害[1-4]。因此，根除HP成為治療幽門螺桿菌相關性胃炎（HAG）的重要課題。滅幽湯是臨床治療HAG的有效復方[5-12]，本研究在前期研究的基礎上，進一步從分子生物學角度探討滅幽湯對HAG小鼠胃組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠56只，雌雄各半，8周齡，體質量（20±5）g，小鼠購進后常規飼養，室溫(20±2)℃，照明晝夜交替時間為12 h∶12 h，自由飲水、進食，適應性喂養3 d，飲食飲水正常、無不良反應者，即納入實驗。動物購自南京君科生物科技有限公司。實驗動物質量合格證號：0017145，許可證號：SCXK（蘇）2011-0003。

1.1.2 HP菌菌種 悉尼標準菌株 （Sydney strain 1，SSI)，SSI含有細胞毒素相關基因(cagA)蛋白和空泡細胞毒素(vacA)，濃度為HP菌液1×109cfu/mL，由湖南中醫藥大學基礎醫學院病原免疫學教研室提供。

1.1.3 實驗造模飼料 普通飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，高糖高脂飼料（普通飼料+ 8%蜂蜜+12%豬油）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司代加工。

1.1.4 藥物 中藥：滅幽湯 （黃芩15 g，蒲公英20 g，陳皮10 g，青皮10 g，白及10 g，三七6 g，烏賊骨15 g），以上飲片均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，飲片浸泡30 min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續煎煮20 min，取汁另置。繼續加水，煎煮沸騰后，文火續煎20 min，取汁。兩次藥汁合并后濃縮至含生藥2 g/mL，并用離心機去除藥汁中殘渣，4℃保存。胃三聯西藥：枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫藥出廠，生產批號：1212248。替硝唑由山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司出廠，國藥準字：H20033090。克拉霉素由杭州中美華東制藥有限公司出廠，國藥準字：H10970216。按照小鼠與人臨床用藥劑量、體型系數公式dB=dA×RB/RA×(WA/ WB)1/4計算小鼠用藥劑量，胃三聯組小鼠用藥劑量均為279.8 mg/kg（參考60 kg成人劑量，成人每次用藥劑量為鉍劑220 mg＋替硝唑500 mg＋克拉霉素250 mg，2次/d），滅幽湯組用藥劑量為12.4 g/kg。

1.1.5 試劑 膠體金法HP檢測試劑盒，艾康生物技術 （杭州）有限公司。一抗兔抗鼠核轉因子p65（NF-κBp65）（批號BA0610）、Toll樣受體2（TLR2）（批號BA1716），均購自武漢博士德生物工程有限公司，生物素標記二抗試劑盒（批號sp9002），購自北京中杉金橋生物技術有限公司。常規化學試劑購自北京化學試劑公司，逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司。

1.1.6 儀器 民橋電子天平；中科美菱-80℃冰箱；eppendorf臺式冷凍離心機；英國Shandon 325型石蠟切片機；德國LEICA LEICA DM LB2型雙目顯微鏡；麥克奧迪實業集團公司Motic B5顯微攝像系統。自制人工濕熱箱：已獲得專利，專利號：201320293029.4。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將56只BALB/c小鼠按體質量分層隨機分為正常對照組、模型組、胃三聯組、滅幽湯組，每組14只。正常對照組予以普通飼料正常飼養，模型組、胃三聯組、滅幽湯組予以高脂飼料飼養10 d，然后放入人工濕熱箱[溫度(35±2)℃，濕度95%±1%]內繼續高脂飼料喂養，于第16天以濃度為1×109cfu/ml HP混懸液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h給食水。隔日感染1次，連續感染3次。感染后定植2周。2周后所有小鼠均斷尾取血以膠體金法檢測HP；抽樣取胃黏膜做病理切片觀察炎癥情況，以及電鏡下觀察HP定植情況。

1.2.2 給藥及樣本處理 滅幽湯和胃三聯組在模型成功后開始給藥，每天灌胃1次，其它組分別灌等量的蒸餾水。給藥后兩周禁食禁水24 h后所有小鼠斷尾取血用于通過膠體金法檢測HP，采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，將BALB/c小鼠仰臥位固定于鼠板，迅速取出胃標本。取胃前，將幽門部和賁門部結扎，在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈。每組按隨機數字表法隨機抽取4個胃組織標本，全部放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，備做免疫組化檢測。

1.2.3 指標檢測及方法 （1）膠體金法檢測HP，電鏡下、光鏡下分別觀察HP定植情況及 HE染色觀察胃黏膜炎癥程度。（2）免疫組化檢測TLR2、NF-κBp65蛋白表達：將小鼠胃組織石蠟切片放入二甲苯5 min×3次，然后依次經梯度酒精脫蠟至水，并用PBS清洗5 min×3次；浸入3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，來阻斷內源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，2 min×3次；65℃烤片2 h后，常規脫蠟至水；高溫檸檬酸鹽修復20 min；放入3%H2O2溶液中浸泡10 min滅活內源性過氧化物酶；0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加 100 μL正常山羊血清封閉15 min，傾去溶液；分別加入一抗兔抗鼠TLR2、NF-κBP65，4℃孵育過夜；0.01 M PBS洗 3 min×2次；加入通用型生物素標記二抗100 μL，37℃30 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；加入過氧化物酶標記鏈霉卵白素100 μL，37℃ 20 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加DAB顯色劑3~5 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。樣本圖像采用CMIAS真彩色病理圖像分析系統進行分析。每個樣本隨機選取5個高倍視野，計算黃褐色陽性表達的面積，以此表示TLR2及NF-κBp65蛋白的表達，然后進行半定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠行為和體態變化

造模前，小鼠活動正常，納香，大便正常，模型組體質量與對照組比較無統計學差異；造模前期小鼠體質量增長較快，后期逐漸變緩，甚至體質量減輕，精神正常，納呆少飲，嗜睡，活動少，毛發松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便干稀不調，肛溫較造模前升高，小便色黃。給藥后，滅幽湯組小鼠體質量逐漸增加，皮毛逐漸順滑，飲水、飲食量增多，活動變多。模型組小鼠仍納差，飲水減少，嗜睡，活動少，毛發松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便干稀不調，肛溫較造模前升高，小便色黃，說明滅幽湯組在改善小鼠攝食、大便等癥狀方面作用明顯。

2.2 各組小鼠陰轉率、組織病理學的比較

模型組小鼠血清HP抗體檢測陽性，藥物治療組治療前后膠體金法HP檢測統計結果（見表1），與模型組比較，滅幽湯組、胃三聯組治療后比較，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；滅幽湯組和胃三聯組治療后比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 HP感染小鼠膠體金法HP檢測結果 （只）

HP定植情況：模型組電鏡下均發現有HP的定植，透射電鏡下觀察到小鼠胃幽門部黏膜表面HP聚集生長；甚至有些小鼠黏膜層細胞水腫，部分HP侵入到黏膜層。見圖1。

各組小鼠胃組織病理改變：光鏡下，正常組小鼠胃黏膜表面光滑，無明顯充血水腫、糜爛，腺體排列整齊。模型組小鼠胃竇部的炎癥程度重，小鼠胃黏膜充血腫脹，表面欠光整，腺體排列較紊亂，可見較多的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，炎癥細胞甚至到達黏膜下層，甚至可見黏膜的出血。胃三聯治療組炎癥程度明顯減輕，固有層僅有水腫，少量淋巴細胞。滅幽湯組小鼠胃黏膜表面稍欠光滑，僅固有層有水腫、無糜爛，腺體排列整齊，僅有少量淋巴細胞浸潤。見圖2（封三彩圖）。

圖1 電鏡下HP定值觀察

2.3 各組小鼠胃黏膜NF-κBp65免疫組化結果

免疫組化圖片中黃褐色區域為陽性表達。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織NF-κBp65僅有少量陽性表達；模型組有大量陽性表達；滅幽湯組和胃三聯組小鼠胃黏膜組織有少量NF-κBp65陽性表達，明顯少于模型組。見圖3（封三彩圖）。

正常組小鼠胃黏膜組織中均有少量 NF-κBp65蛋白表達。與正常組比較，模型組小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表達增加，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯組小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表達降低，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；滅幽湯組與胃三聯組比較，NF-κBp65表達差異無統計學意義（P＞0.05)。結果見表2。

表2 各組小鼠胃黏膜組織NF-κBP65蛋白表達的比較（±s，n=8）

表2 各組小鼠胃黏膜組織NF-κBP65蛋白表達的比較（±s，n=8）

注：與正常組比較＃P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01。下表同。

組別正常組模型組胃三聯組滅幽湯組藥物劑量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg NF-κBP65（×103μm2）189.13±66.14 1 605.90±288.04#453.89±145.32** 421.49±137.32**

2.4 各組小鼠胃黏膜TLR2免疫組化結果

免疫組化圖片中黃褐色區域為陽性表達。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織TLR2幾乎無陽性表達；模型組小鼠胃黏膜組織TLR2有大量陽性表達；滅幽湯組和胃三聯組小鼠胃黏膜組織有少量TLR2陽性表達，明顯少于模型組。見圖4（封三彩圖）。

正常組小鼠胃黏膜組織中僅有少量TLR2蛋白表達。與正常組比較，模型組小鼠胃黏膜TLR2蛋白表達增加，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯組小鼠胃黏膜TLR2表達降低，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；滅幽湯組與胃三聯組比較，TLR2表達差異無統計學意義（P＞0.05)。結果見表3。

表3 各組小鼠胃黏膜組織TLR2蛋白表達的比較（±s，n=8）

表3 各組小鼠胃黏膜組織TLR2蛋白表達的比較（±s，n=8）

組別正常組模型組胃三聯組滅幽湯組藥物劑量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg TLR2（×103μm2）118.48±48.54 1 580.52±276.82#339.70±120.37** 327.68±76.99**

3 討論

Toll樣受體是一種定位于細胞膜的跨膜蛋白，可感知病原體的存在并啟動機體防御相關基因的表達，從而發揮抵抗細菌感染的作用[13]，其中TLR2研究較多且作用相對明確。TLR2作為主要分布于單核/巨噬細胞的一種主要TLRs，能分別識別G+菌成分和G-菌成分等病原體的模式識別受體，通過在侵入部位導致該轉錄因子的轉位與相應免疫基因的活化而轉錄，產生促炎細胞因子、趨化因子及其他炎癥介質等起到調節炎癥反應的作用[14-15]。國外學者研究表明HP感染及其菌體成分可上調TLR的表達[16]，Kawahara和Takenaka等[17-18]研究證實HP及其脂多糖和熱休克蛋白60(Hsp60)通過TLR尤其是TLR2信號通路激活NF-κB和刺激白細胞介素-8（IL-8）分泌，引起炎癥反應。

NF-κB是一種重要的核轉錄因子，是普遍存在于細胞質中的快反應轉錄因子，位于TLR下游信號通路的樞紐位置。在靜息狀態下，NF-κB大多以p65，p50蛋白二聚體與NF-κB抑制因子(IKB)偶聯，以無活性的復合體形式存在于細胞質中。與IKB解離的NF-κBp65可反映NF-κB的活性。IKKβ[19]是I-κB磷酸化激酶，它誘導IκB磷酸化，使NF-κB/I-κB二聚體解離，暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提。活化的NF-κB能與DNA特定的kB位點結合，啟動和調節眾多參與炎癥反應、免疫反應有關基因的轉錄，調控腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素(IL-lβ、IL-6、IL-8)等細胞因子和細胞間黏附分子-l(VCAM-1)等黏附分子的表達，在機體的炎癥、免疫反應等方面發揮重要作用。本研究組前期已證實[12]，滅幽湯可能通過影響NF-κB和IKKβ的蛋白表達達到治療HAG的作用。

HAG歸屬于中醫胃脘痛、痞滿、嘈雜、反酸等范疇，絕大多數的研究結果顯示慢性胃病脾胃濕熱證的HP感染率較高[20-23]。 滅幽湯方[5-12]是王小娟教授結合多年的臨床經驗組方而成，以清熱利濕為基本組方原則。方以黃芩、蒲公英清熱燥濕解毒藥為君，以除脾胃之濕熱；青皮、陳皮行肝脾氣滯以疏通氣機；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陳皮協調氣血之運行，又收斂生肌修復局部之病灶；重用烏賊骨制酸止痛而為之使。現代研究表明：黃芩、蒲公英能抗多種病原微生物，對多種球菌和桿菌有殺滅作用；烏賊骨含有豐富碳酸鹽和磷酸鹽能改變胃的酸性內環境，抑制HP的生長；白及祛腐生肌可修復糜爛的胃黏膜；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促進血液循環消除組織水腫，促進黏膜增生，加快修復。

本實驗采取復合因素（肥甘食物+濕熱環境+幽門螺桿菌）建立脾胃濕熱型HAG小鼠模型，模型成功評定：小鼠以膠體金法檢測HP顯示陽性、電鏡下實驗組均發現有HP的定植；小鼠一般生理表現：精神萎頓，好睡，活動少，納呆，飲水減少，毛發松弛毛糙，陰囊松馳下垂，大便偏稀，小便色黃，體質量減輕，肛溫升高；光鏡下HE染色觀察胃黏膜炎癥程度，發現小鼠胃黏膜充血腫脹，表面欠光整，腺體排列較紊亂，可見較多的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，甚至到達黏膜底層，黏膜未見糜爛。

本研究結果顯示：TLR2、NF-κBp65在模型組中表達均高于正常組，給予滅幽湯干預后TLR2、NF-κBp65明顯降低，HAG小鼠胃黏膜組織炎癥亦明顯減少，說明根除幽門螺桿菌后能下調TLR2、抑制NF-κBp65的激活，從而阻止NF-κB的活化，進而達到抗炎作用。因而我們推測滅幽湯可能是通過選擇此靶點來治療HAG。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBp65 in Gastric Mucosa Tissues of Mice with Helicobacter pylori-related Gastritis

WANG Xiaojuan1,YIN Jiao2,GUO Jiansheng2,YU Bin2*,DU Zhonghua2,LUO Yan2,XIA Rong2
（1.The first Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 401208,China）

Objective To explore effects and action mechanism of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBP65 in gastric mucosa tissues of mice with Helicobacter pylori-related gastritis Methods BALB/c mice were randomly assigned to normal control group,model group,gastric triad group,Mieyou group,developed a model of HAG BALB/c mice Spleen-stomach Damp-heat Syndrome by composite factors (high sugar and fat food+hot and humid environment+H. Pylori).The immunohistochemical assay was adopted to detect the protein expressions of nuclear transcriptionfactorTLR2andNF-κBP65.ResultsComparedwithnormalcontrolgroup,theexpressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice(model group)increased (P＜0.05),compared with model control group,the expressions decreased in Mieyou Decoction group (P＜0.05).Conclusion Mieyou Decoction can eradicate H．pylori,regulate the expressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice,alleviate gastric mucosal inflammation.HAG was treated by Mieyou Decoction probably through down-regulating the expressions of TLR2, inhibiting the activation of NF-κBp65,thus hindering the activation of NF-κB,then producing treatment effect.

H.pylori;Gastritis;Mieyou Decoction;TLR2；NF-κBp65

R573.3；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.004.018.05

2013－10－08

湖南省自然科學基金資助項目(12JJ2046)；湖南省科技廳科研資助項目(2011SK3096)；湖南省科普計劃資助項目(2013KP0111)；湖南中醫藥大學研究生校級科研資助項目。

王小娟，女，教授，碩士研究生導師，研究方向：消化系統疾病研究。

*喻 斌，男，碩士，教授，碩士研究生導師，E-mail：272445871@qq.com。