同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法測定魚肉中8 種全氟化合物

賀小敏，陳 浩*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省環境監測中心站，湖北 武漢 430072；3.華中農業大學理學院，湖北 武漢 430070）

全氟化合物（perfluorinated compounds，PFCs）是化合物分子中與碳原子連接的氫原子完全被氟原子取代的一類有機化合物，具有獨特的疏水、疏油特性，其分子結構中含有極高鍵能的碳氟鍵，因而其化學穩定性高、生物惰性強，在環境中難以光解、水解及生物降解。早在20世紀50年代，PFCs就廣泛應用于表面處理、紙張保護、工業清洗劑、防火泡沫、地板拋光劑等民用及工業領域[1]。PFCs能夠誘發肝中毒，具有發育毒性、免疫毒性、內分泌干擾等生物毒性[2]。在2009年5月召開的《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》第四次締約方大會上，全氟辛基磺酸及其鹽和全氟辛基磺酰氟被正式列入持久性有機污染物名單附件B加以限制。大量的研究證明，PFCs能通過各種途徑進入土壤、水體、大氣等環境介質中，并通過食物鏈傳遞放大[3]。PFCs在各類環境介質、生物體和人體中均能檢出，并且存在于全球各個地方甚至南北極地區[1,4-5]，因而PFCs 造成的污染引起了人們的廣泛關注。

PFCs的檢測方法有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[6]、氣相色譜質譜（gas chromatography- mass chromatography，GC-MS）法[7]、液相色譜-熒光探測器法[8]、離子排斥色譜法[9]、液相色譜質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[10]和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）法[11-13]。其中GC、GC-MS和HPLC-熒光探測器法在分析前需要對PFCs衍生化，其處理過程復雜；離子排斥色譜法僅適用于分析短鏈PFCs；HPLC-MS中單四極桿質譜在分析復雜樣品時靈敏度低、抗干擾能力弱，離子阱質譜適用于PFCs同分異構體的定性和結構解析，對于痕量PFCs靈敏度較低；HPLC-MS-MS中，四極桿-飛行時間質譜儀具有很高的分辨率，能夠對環境中大多數PFCs進行定性，但與三重四極桿質譜儀相比，其靈敏度較低，線性范圍較窄；HPLC-MS-MS特別是高效液相色譜-負電噴霧-三重四極桿串聯質譜法在分析復雜樣品中PFCs含量時，選擇性和靈敏度高、檢出限低[14]，能簡化復雜基質的前處理過程，在痕量的PFCs檢測分析中具有顯著的優勢。

魚是人類重要的膳食成分，建立魚肉中PFCs的分析方法對于人類健康具有重要意義。目前，魚體中PFCs的分析方法已有一些研究，多采用堿液消解或混合無機酸消解-固相萃取-HPLC-MS-MS法[11-13]。這些方法前處理步驟復雜，且大多采用外標法或個別同位素作為內標的多種PFCs同時測定方法，由于外標法易受環境及儀器條件的變化而影響測定準確度，以個別同位素作為內標的方法又難以較好補償樣品預處理及檢測過程中的諸多因素對其他PFCs檢測結果的影響。同位素稀釋法是在試樣處理前加入待測化合物的同位素，利用同位素比值的變化來定量測定待測化合物濃度的方法。隨著該技術的發展，應用同位素稀釋技術進行質譜確認，能夠準確地定性和定量，彌補了外標法或一般內標法的不足，提高了分析結果的準確性和可靠性。本實驗在前人研究的基礎上，利用同位素稀釋技術，采用乙腈超聲萃取魚肉中8 種PFCs，經弱陰離子固相萃取柱凈化分離，由UPLC-MSMS分析檢測。該方法簡化了前處理步驟，具有凈化效果好、定量準確、靈敏度高的特點，擴大了魚樣中PFCs的分析方法，用于實際魚肉中PFCs的分析測定，獲得了滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉，來自湖北丹江口水庫魚樣，取肌肉組織冷凍干燥。

全氟丁酸（perfluoro-n-butanoic acid，PFBA，CAS 375-22-4）、全氟己酸（perfluoro-n-hexanoic acid，PFHxA，CAS 307-24-4）、全氟辛酸（perfluoro-noctanoic acid，PFOA，CAS 335-67-1）、全氟壬酸（perfluoro-n-nonanoic acid，PFNA，CAS 4149-60-4）、全氟癸酸（perfluoro-n-decanoic acid，PFDA，CAS 335-76-2）、全氟十一烷基酸（perfluoro-n-undecanoic acid，PFUnDA，CAS 2058-94-8）、全氟十二烷基酸（perfluoro-n-dodecanoic acid，PFDoDA，CAS 307-55-1）、全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS，CAS 1763-23-1）標準溶液，質量濃度均為50 μg/mL，PFCs同位素標準混合溶液（MPFAC-MXA，包含perfluoro-n-[1,2,3,4-13C4]butanoic acid (MPFBA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]hexanoic acid (MPFHxA)、perfluoron-[1,2,3,4-13C4]octanoic acid (MPFOA)、perfluoro-n-[1,2,3,4,5-13C5]nonanoic acid (MPFNA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]decanoic acid (MPFDA)、sodium perfluoro-1-[1,2,3,4-13C4]octanesulfonate (MPFOS)、perfluoro-n-[1,2-13C2]undecanoic acid (MPFUnDA)、perfluoro-n-[1,2-13C2]dodecanoic acid (MPFDoDA)，質量濃度為2 μg/mL，以上標準溶液均購自加拿大威靈頓實驗室；乙腈（HPLC級）、甲醇（HPLC級） 韓國Duksan公司；乙酸（HPLC級） 美國Tedia公司；乙酸銨（HPLC級）、氨水（25%，HPLC級） 美國Anaour公司；屈臣氏蒸餾水；活性炭（100目） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

1290 UPLC-6460 QQQ MSD超高效液相色譜-串聯質譜儀、1 mL聚丙烯樣品瓶 美國Agilent公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿有限公司；visiprep 24TM DL固相萃取裝置美國Supelco公司；Oasis WAX 6 mL/150 mg弱陰離子固相小柱 美國Waters公司；TURBOVAP Ⅱ氮吹儀 美國Biotage公司；H2100R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；KQ-600DV超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；25、100、1 000 μL精密移液器德國Brand公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

PFCs標準儲備液的配制：分別移取20 μL PFBA、PFHxA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA和PFOS標準溶液（質量濃度均為50 μg/mL）置1 mL聚丙烯小瓶中，用840 μL甲醇稀釋定容至1 mL，混勻后得到1 μg/mL PFCs標準儲備液。

PFCs標準中間液的配制：吸取10 μL質量濃度為1 μg/mL PFCs標準儲備液置1 mL聚丙烯小瓶中，用990 μL甲醇稀釋定容至1 mL，混勻后得到10 μg/L PFCs標準中間液。

PFCs同位素標準中間液的配制：吸取100 μL質量濃度為2 μg/mL MPFAC-MXA標準溶液至1 mL聚丙烯小瓶中，用990 μL甲醇稀釋定容至1 mL，混勻后得到200 μg/L PFCs同位素標準中間液。

PFCs標準系列溶液的配制：分別移取10、20、50、100 μL和200 μL質量濃度為10 μg/L PFCs標準中間液至1 mL聚丙烯小瓶中（先加入500 μL純水和50 μL質量濃度為200 μg/L同位素標準中間液），再分別加入440、430、400、350 μL和250 μL甲醇稀釋定容至1 mL，混勻后得到0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L和2.0 μg/L標準系列溶液（其中同位素內標質量濃度為10 μg/L）；再分別移取5、10、20 μL和50 μL質量濃度為1 μg/mL PFCs標準溶液置1 mL聚丙烯小瓶中（先加入500 μL純水和50 μL 質量濃度為200 μg/L PFCs同位素標準中間液），再分別加入445、440、430 μL和400 μL甲醇稀釋定容至1 mL，混勻后得到5.0、10.0、20.0 μg/L和50.0 μg/L PFCs標準系列溶液（其中同位素內標質量濃度為10 μg/L）。

1.3.2 樣品前處理

將新鮮魚樣用水洗凈后，解剖，取出肌肉組織經冷凍干燥后，研磨成細碎粉狀，混勻后轉入樣品瓶冷凍保存，以備分析用。準確稱取1.00 g冷凍干燥后的魚肉樣品放入100 mL聚丙烯離心管中，加入40 mL乙腈和5 μL質量濃度為2 μg/mL MPFAC-MXA標準溶液。將樣品加蓋并超聲萃取30 min，取出樣品以3 500 r/min轉速離心10 min，將上清液轉入50 mL 聚丙烯離心管；向裝有樣品的離心管中再加入30 mL乙腈，超聲萃取30 min，重復上述步驟合并兩次上清液，氮吹濃縮至10 mL，加入40 mL純水，得到萃取液的乙腈溶液。

利用大容量采樣器將樣品及預淋洗過的固相萃取小柱（使用前，依次用4 mL 0.5%氨水甲醇溶液、4 mL甲醇和4 mL水預活化）串聯，開通真空泵，調節流速3～5 mL/min，使萃取液的乙腈溶液通過固相萃取柱，待樣品完全流出后，用5 mL高純水和5 mL醋酸鹽緩沖溶液（pH 4）依次清洗固相萃取柱，棄去全部流出液。將固相萃取柱用5 mL甲醇清洗，再加入8 mL 0.5%氨水甲醇溶液淋洗得到目標物，收集洗脫液于10 mL聚丙烯離心管中，40℃氮吹濃縮至0.5 mL以下，加入500 L水后用甲醇定容至1 mL，將溶液（若混濁，需用適量活性炭去除雜質）過0.22 m濾膜后，用UPLC-MS-MS分析測定。

1.3.3 色譜與質譜條件

色譜條件：ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，3.5 m）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 L；以10 mmol乙酸銨溶液（A）和乙腈（B）進行梯度洗脫，0～1 min，70% A＋30%B；1～12 min，70% A＋30% B→10% A＋90% B；12～13 min，10% A＋90% B→ 70% A＋30% B。

質譜條件：采用電噴霧離子源，負離子模式；多反應監測方式；霧化器壓力：276 kPa；干燥氣流速8 L/min；干燥氣溫度350 ℃；毛細管電壓4 000 V；定性離子對、定量離子對、電離能量和碰撞能見表1。

表 1 質譜檢測條件Table 1 Mass spectrometry conditions

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

PFCs同時具有疏水和疏油性質，并具有一定的表面活性和極性，因此采用較低硅羥基活性填料的C18反相柱可以實現這類化合物的分離。本研究選擇同填料（ZORBAX Eclipse plus C18）但不同粒徑的色譜柱A（50 mm×2.1 mm，1.8 m）和色譜柱B（100 mm×3.0 mm，3.5 m）進行分離比較，當采用乙腈和10 mmol/L醋酸銨溶液作為流動相進行梯度洗脫時，色譜柱A在5 min內能實現8 種PFCs的良好分離，并且得到了滿意的分辨率和靈敏度。但該色譜柱填料粒徑（1.8 m）太細，實際分析過程中容易造成色譜柱堵塞，即使在安裝了預柱和每天更換流動相的情況下，該粒徑的色譜柱使用壽命仍然較短（同樣流動相條件下，每次柱壓增加幅度達到10%以上），造成分析成本大大提高。當選用色譜柱B時，8種PFCs在10 min內能實現良好的分離，化合物峰形尖銳，信號質量高，且色譜柱便于維護，不易堵塞（同樣條件下，每次柱壓增幅小于1%），使用壽命大大延長。綜合考慮以上因素，選擇色譜柱B，即ZORBAX Eclipse plus C18（100 mm×3.0 mm，3.5 m）色譜柱既能獲得良好的分離效果，又能得到合理的分析時間，且大大降低了分析成本。

2.2 質譜條件的優化

由于PFCs化學結構中具有羧基或磺酸基，因此采用負離子反應模式監測靈敏度較高。本實驗采用0.1 mg/L PFCs標準溶液在負離子模式下進行母離子全掃描，調節電離電壓和錐孔電壓，確定各PFCs的準分子離子，并以準分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，優化子離子及碰撞能量，確定其中選擇性最強的子離子作為監測離子，最后以多反應監測模式進行采集。8 種PFCs及其同位素標準溶液（MPFAC-MXA，質量濃度為10 μg/L）的總離子流色譜圖見圖1，PFCs在10 min 內全部流出，其中PFBA最先流出，PFDoDA最后流出。隨著碳鏈的增加，全氟酸類化合物在C18柱上的保留逐漸增大，同一碳鏈數全氟磺酸類化合物保留強于全氟羧酸類化合物。

1. PFBA＋MPFBA；2. PFHxA＋MPFHxA；3. PFOA＋MPFOA；4. PFNA＋MPFNA；5. PFDA＋MPFDA；6. PFOS＋MPFOS；7. PFUnDA＋MPFUnDA；8. PFDoDA＋MPFDoDA。

2.3 前處理方法優化

PFCs常見的提取溶劑有離子對試劑、酸、堿和有機溶劑等，其中乙腈對大部分PFCs的提取效率大于其他溶劑[15]，本實驗選擇乙腈作為提取劑。在提取過程中，乙腈可以使魚肉中大量蛋白質變性形成沉淀，然后通過離心去除蛋白沉淀。但含脂量較高的樣品在用乙腈進行蛋白沉淀時，容易將樣品中的部分脂肪和水溶性雜質提取出來，造成提取液混濁，在液相色譜-質譜聯用分析時可能產生基質干擾和色譜柱污染，需對提取液進一步凈化[16]。

本實驗比較了Waters Oasis HLB和Waters Oasis WAX固相萃取柱對PFCs提取液的凈化效果。當使用HLB柱進行富集后，使用5%甲醇溶液淋洗，純甲醇洗脫時，短鏈PFCs損失較大；而使用WAX柱富集，目標物經5 mL醋酸鹽緩沖溶液（pH 4）鎖定后，再用5 mL甲醇清洗，0.5%氨水甲醇溶液洗脫時，8 種PFCs的回收率均在80%以上，因此本實驗選擇WAX固相萃取柱對樣品提取液進行凈化。

在WAX固相萃取柱上注入50 μL質量濃度為1 μg/mL PFCs標準溶液，用0.5%氨水甲醇溶液進行洗脫，分段收集洗脫組分（每1 mL收集一管），共收集10 個流分（共10 mL），由于氨水甲醇溶液（洗脫劑）pH值呈堿性，直接進行洗脫流分（每個流分1 mL）的測定峰形很差，大部分目標物出現峰分裂現象，無法準確定量，不能較好繪制出洗脫曲線。但不同流分中PFCs的總離子流圖表明5 mL洗脫劑能使大部分PFCs洗脫出來。當洗脫劑用量為8 mL時，第8個組分（1 mL）中基本沒有PFCs檢出，為充分保證目標化合物的回收率，本實驗洗脫體積定為8 mL。

2.4 線性范圍、檢出限、精密度和準確度

在選定的分析條件下，將0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L PFCs標準系列溶液按質量濃度從低到高的順序依次進行UPLC-MS-MS分析測定，以內標法定量，各PFCs的線性范圍和檢出限如表2所示。8 種PFCs在0.1～50 μg/L范圍內呈現良好的線性關系，相關系數在0.998 7～0.999 1之間。以1 g魚肉樣品經處理后定容至1 mL為計，該方法對樣品中PFCs的檢出限為0.03～0.15 μg/kg。

在1 g魚肉中添加10 μL質量濃度為1 μg/mL PFCs標準溶液，添加同位素內標各10 ng，按照實驗選定的最佳條件，測定8 種PFCs的加標回收率，并分析其相對標準偏差，見表2。8 種PFCs的平均加標回收率在87.7%～104.4%之間，相對標準偏差為4.1%～10.7%，說明該方法回收率較高，重復性較好，能夠滿足分析測定的需求。

表 2 8 種PFCs的線性范圍、相關系數、方法檢出限、回收率和相對標準偏差Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, limits of detection,recoveries and relative standard deviations (RSDs) for 8 PFCs

2.5 實際樣品分析

采用優化的前處理方法和分析條件，對2013年6月從丹江口水庫采集的魚樣進行PFCs分析測定，結果見表3?？梢钥闯?，魚肉中PFOA的檢出率為50%，其余7 種PFCs檢出率均達到100%，表明魚體中存在著一定的PFCs污染。魚肉中∑PFCs的含量在3.02～38.9 μg/kg之間，平均值為（16.5±13.2） μg/kg，其值低于國內其他地區[17-20]所報道的含量值。本研究中魚樣肌肉組織中PFOS的含量最高，在1.00～14.1 μg/kg之間，平均含量為（5.63±4.98）μg/kg，其次為P F U n D A（0.6 1～1 3.3 μ g/k g），這與文獻[13]報道的結果基本一致。總體而言，短鏈PFCs在魚類肌肉組織中富集濃度較低，長鏈PFCs富集相對明顯且普遍。

表 3 實際魚肉測定結果Table 3 Analytical results for actual fish musclesμg/kg

3 結 論

本實驗對比了不同粒徑色譜柱對PFCs的分離效果，并對樣品前處理方法進行了優化，建立了同位素稀釋-UPLC-MS-MS測定魚肉中8 種PFCs的分析方法。該方法的加標回收率高，精密度較好，對實際魚肉中8 種PFCs的分析結果表明，魚體中存在著一定的PFCs污染。

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