TIP30基因表達對吉非替尼體內抑瘤作用的影響研究

陳錦章，黃維，鄭大勇，阮健，陳逢生，李愛民

(1.南方醫科大學南方醫院腫瘤內科，廣東廣州 510515；2.順德第一人民醫院腫瘤科，廣東順德 528300)

TIP30基因表達對吉非替尼體內抑瘤作用的影響研究

陳錦章1，黃維2，鄭大勇1，阮健1，陳逢生1，李愛民1

(1.南方醫科大學南方醫院腫瘤內科，廣東廣州 510515；2.順德第一人民醫院腫瘤科，廣東順德 528300)

目的探討TIP30基因的表達與吉非替尼體內抑瘤作用的相關性。方法選取小鼠24只，隨機分為實驗組和對照組，每組12只。兩組小鼠均經皮下種植肺癌細胞獲得腫瘤模型，實驗組通過沉默TIP30基因建立TIP30低表達模型，對照組裸鼠則不作任何處理，利用實時定量PCR和Western blot方法檢測兩組TIP30基因的表達情況。對兩組小鼠未用吉非替尼10mg/d進行處理，15 d后觀察兩組小鼠的體內腫瘤抑制程度。結果成功建立小鼠肺癌模型，實驗組TIP30表達情況顯著低于對照組，兩組表達情況比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。對兩組小鼠利用吉非替尼進行處理后，在第5天兩組的瘤體平均重量未見顯著差異，但第7天及第15天實驗組瘤體重量顯著低于對照組(P＜0.05)，病理切片顯示實驗組腫瘤抑制效果明顯強于對照組。結論TIP30基因對吉非替尼的體內抑瘤作用具有促進作用。

TIP30；肺癌；表皮生長因子受體；體內研究

近年來，我國的肺癌發病率呈逐年上升的趨勢，對肺癌進行進一步的診斷和治療顯得尤為重要[1]。目前靶向藥物治療肺癌發展較為迅速，其中表酪氨酸蛋白激酶抑制劑——表皮生長因子受體(Epithelial grow th factor receptor，EGFR)在非小細胞肺癌的治療中起著重要的作用[2]。TIP30是一種抑癌基因，最近幾年研究表明其在多種腫瘤組織中表達均較正常組織有所下調，且敲除TIP30基因，可導致腫瘤的發生和轉移[3-4]。有報道[5]TIP30在肺癌組織中的亦稱低表達，但TIP30的表達情況與吉非替尼的抑瘤作用相關研究筆者未見報道。我們2012年10月通過肺癌的動物模型對TIP30的表達與吉非替尼抑瘤作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞采用C57BL/6N的近交系小鼠24只，體重為18～22 g，鼠齡約8周，隨機分為實驗組和對照組，各12只。由南方醫科大學實驗動物中心提供；肺癌細胞株由上海撫生試劑公司提供。

1.1.2 實驗藥物吉非替尼由AstraZeneca(英國)公司提供，1640細胞培養基購自Hy-clone公司，PCR試劑盒購自Boeh-ringer公司、引物和DNA片段購自上海博亞有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌小鼠動物模型的建立采用慢病毒載體干擾實驗組的內源性TIP30表達，采用Western blot及Qt-PCR定量檢查TIP30基因的表達情況，確認實驗組目標基因呈低表達狀態，之后將在體外進行培養后處在對數生長期的肺癌細胞制成細胞懸液，并接種到小鼠皮下，部位選取右前肢，接種濃度為每只107個細胞。觀察皮下腫瘤生長情況。兩組小鼠分別于給藥后5 d、7 d及15 d各處死4只，將所得組織進行重量的計算并行統計分析，之后進行病理切片檢查。

1.2.2 病理學檢查各組小鼠進行解剖獲得腫瘤組織，通過10%福爾馬林固定后，采用石蠟包埋、切片，進行依紅-蘇木精染色。成片后在光鏡下進行腫瘤組織的觀察，評價不同用藥時間后的腫瘤惡性程度。

1.3 統計學方法采用SPSS13.0進行分析，兩組大鼠的瘤體重量比較采用t檢驗。由于數據較少，且Rt-PCR定量數據和瘤體平均重量呈非正態分布，數據采用秩和檢驗進行分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。統計作圖采用Graphpad 5.0進行繪制。

2 結果

2.1 兩組TIP30表達情況實驗組大鼠經基因沉默方法對TIP30基因進行沉默，各組隨機取一只大鼠進行靶向基因表達檢測。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參進行Western Blot檢測，結果顯示TIP30在實驗組中表達量顯著少于對照組(圖1)，且Rt-PCR結果也顯示上述差異具有顯著統計學意義(P＜0.01，圖2)。

圖1 實驗組大鼠沉默TIP30基因后TIP30表達情況

圖2 RT-PCR檢測兩組細胞中TIP30水平差異情況

2.2 兩組吉非替尼處理后效果兩組大鼠均接受吉非替尼10mg/d處理后15 d觀察瘤體組織顯示，實驗組瘤體縮小程度顯著強于對照組(圖3)。

圖3 兩組大鼠接受吉非替尼處理15 d后瘤體組織比較

2.3 兩組大鼠病理結果比較在第5天、第7天及第15天對瘤體組織進行病理切片檢查，均見實驗組腫瘤細胞情況顯著較對照組差(圖4)。兩組大鼠瘤體平均重量在第5天未見明顯差異(t=0.30，P=0.77)，而在第7天(t=3.64，P＜0.01)及第15天(t=4.66，P＜0.01)差異具有統計學意義(圖5)。

圖4 兩組大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的病理切片比較

圖5 兩組大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的瘤體平均重量

3 討論

早期轉移時肺癌的一大特征，也是肺癌患者治療失敗的主要原因之一。雖然目前已有眾多的臨床治療手段，但至今肺癌的5年存活率仍較低[6]，在全世界各癌癥的死亡人數中比例約高達17%[7]。故對于肺癌的早期治療和新型治療方法的探討具有重大意義。目前隨著分子生物學信號通路的研究，生物靶向治療在臨床上越來越受到重視[8]。其中在肺癌的臨床治療上較為成功的即為EGFR相關基因的突變與肺癌發生的研究，而TIP30蛋白屬于新型腫瘤轉移的抑制基因，文獻顯示它與EGFR之間具有一定聯系[9]。對于該基因表達的上調和下調對EGFR靶向治療藥的效果是否具有增強或抑制作用尚未見有相關文獻報道。

我們本次研究通過構建TIP30基因低表達肺癌的動物模型，采用EGFR抑制劑吉非替尼對TIP30正常的肺癌模型組合低表達TIP30基因的實驗組進行了干預實驗。結果顯示實驗組小鼠TIP30基因呈低表達，而兩組在接受吉非替尼處理后，第5天兩組的瘤體重量未見明顯差異，而實驗組第7天及第15天兩組的瘤體重量減少程度均明顯大于對照組小鼠。病理切片仍證實了隨著時間變化，實驗組的抑瘤效果明顯強于對照組。

TIP30屬于一種腫瘤抑制基因，文獻報道在眾多的腫瘤組織中均呈低表達情況[10-12]。有研究證明TIP30在肝細胞癌中的抑瘤作用可能是通過抑制ETS1蛋白及AP1等協同OPN啟動子區域的nt266下調OPN表達從而抑制肝細胞癌的侵襲轉移[13-14]。但這一機制并未在其他腫瘤組織中得以證實。

吉非替尼是EGFR的靶向小分子酪氨酸激酶抑制劑，其主要作用是抑制EGFR胞內區的酪氨酸激酶的活性。文獻報道TIP30進行基因敲除后可加快EGFR細胞核內化，以及可使肺上皮干細胞及祖細胞數目增加，導致EGFR表達上調，激活EGFR下游信號通路，從而促進肺癌的發生和轉移[15]。而我們研究發現TIP30基因抑制的小鼠對吉非替尼的敏感性更強，這提示TIP30可作為吉非替尼療效的預測指標。

綜上所述，TIP30的抑制可增強EGFR抑制劑吉非替尼的抑瘤敏感性，但是否還受諸如遺傳等其他因素的影響仍需進一步研究。

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Correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effect of gefitinib in the treatment of lung cancer in vivo.

CHEN Jin-zhang1,HUANGWei2,ZHENGDa-yong1,RUAN Jian1,CHEN Feng-sheng1,LIAi-min1.1.Department of Oncology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA;2.Department of Oncology,the FirstPeople's Hospital of Shunde,Shunde,528300,Guangdong,CHINA.

Objectivee To investigate the correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effectof gefitinib in the treatmentof lung cancer in vivo.Methods Twelvemicewere random ly divided into experimental group and control group.Tumormodelwereestablished in two groups by subcutaneous injection of lung cancer cells.TIP30 low-expressionmodelwas established by silencing TIP30 genes in the experimentgroup;however,therewas no any treatment in the control group.Then we used the real-time quantitative PCR and western blotmethod to detect the TIP30 gene expression.Gefitinib were used in both groups in a concentrate of 10mg/d.As a result,both the anatom y and pathological effect of tumor inhibition were found after 15 days.ResultsThe lung cancermodels inmicewas successfulestablished.Real-time quantitative PCR and w estern blot confirmed thatexpression of TIP30 in experimental group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).After the first five days there was no statistical difference between groups in theaverageweightof tumor on theuse of gefitinib,while therewere significant statistical differences between groups at the first7 days and 15 days(P＜0.05).PathologicalResultsalso showed that the tumor inhibitory effect in experimental group was significantly stronger than that in controlgroup.ConclusionTIP30 gene can havea facilitating role in theantitumoreffect in vivo.

TIP30;Lung cancer;Epithelialgrow th factor receptor(EGFR);In vivo

R-332

D

1003—6350（2014）04—0472—03

2013-08-26)

廣東省自然科學基金（編號：S2012010009392）；南方醫院院長基金（編號：2011C001）

李愛民。E-mail：Liaimin2005@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0184