一種通用型piggyBac轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)細胞永生化載體的構(gòu)建及其基本功能驗證

黃惠，胡廣東，康健，卿素珠，張涌

1 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院, 陜西 楊凌 712100

2 西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)重點實驗室, 陜西 楊凌 712100

動物及獸醫(yī)生物技術(shù)

一種通用型piggyBac轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)細胞永生化載體的構(gòu)建及其基本功能驗證

黃惠1,2，胡廣東1,2，康健1,2，卿素珠1，張涌1,2

1 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院, 陜西 楊凌 712100

2 西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)重點實驗室, 陜西 楊凌 712100

為了構(gòu)建一種高效、通用的細胞永生化載體pTP-hTERT，通過人工合成、PCR、酶切連接等方法，對傳統(tǒng)piggyBac (PB) 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進行改造。改造后的載體含有轉(zhuǎn)座必需元件、PB轉(zhuǎn)座酶 (PBase) 表達框、共表達篩選元件和人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶 (hTERT) 基因表達框。其中篩選元件中綠色熒光蛋白 (EGFP)基因和嘌呤霉素抗性 (Puror) 基因以豬捷申病毒2A自我剪切肽相連，以實現(xiàn)共表達。為驗證載體元件功能，使用該載體轉(zhuǎn)染HEK 293細胞，并對篩選出的陽性細胞進行RT-PCR、Western blotting (WB)、熱不對稱PCR (Tail-PCR) 和細胞克隆亞甲藍染色與統(tǒng)計分析。載體測序鑒定與細胞培養(yǎng)結(jié)果表明，通用型永生化載體 pTP-hTERT構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HEK293細胞后能篩選出抗嘌呤霉素細胞單克隆；WB結(jié)果顯示P2A可高效切割EGFP和Puror融合蛋白，證明篩選標記基因功能正常；Tail-PCR結(jié)果表明該載體以轉(zhuǎn)座整合插入宿主基因組；亞甲藍染色統(tǒng)計結(jié)果顯示由pTP-hTERT引發(fā)的細胞陽性克隆數(shù)與對照組相比顯著提高 (P＜0.01)。PB轉(zhuǎn)座子永生化載體pTP-hTERT的構(gòu)建為永生化細胞系的建立提供了工具，同時也為其他真核載體的構(gòu)建和改造提供了參考。

piggyBac (PB) 轉(zhuǎn)座子，P2A，融合蛋白，hTERT

轉(zhuǎn)座子 (Transposon) 是一類能在宿主基因組中變更插入位置的可移動遺傳因子，其變更插入位置的過程被稱為轉(zhuǎn)座 (Transposition)。……