蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達及其功能分析

杜次，李菁，唐云濤，彭清忠

1 吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000

蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達及其功能分析

杜次1,2，李菁1,2，唐云濤1,2，彭清忠1,2

1 吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000

賴氨酸脫羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC) 是抗老年癡呆藥——石杉堿甲生物合成的第一個酶。為了研究蛇足石杉中LDC的特性和功能，以其總RNA為模板，通過RT-PCR擴增得到2個賴氨酸脫羧酶基因LDC1和LDC2，克隆至pMD?19-T中測序發現，兩基因同源性為95.3%，分別編碼212和202個氨基酸。將兩基因引入pET-32a(+)構建重組表達質粒pET-32a(+)/LDC1和pET-32a(+)/LDC2，分別轉入BL21(ED3)中進行誘導表達，在30 ℃條件下獲得可溶性表達產物Trx-LDC1和Trx-LDC2；采用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，建立酶促反應體系分析其脫羧酶活性，薄層層析 (TLC) 檢測表明重組融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2均能催化賴氨酸脫羧生成尸胺。利用生物信息學軟件分析發現LDC1和LDC2理化性質存在差異，但預測的二級結構和三維結構基本一致。

蛇足石杉，賴氨酸脫羧酶，基因克隆，原核表達，酶活性，結構預測

蛇足石杉[Huperzia serrata (Thumb.) Trev.]為石杉科石杉屬蕨類植物，別名千層塔、金不換、蛇足草等，系我國傳統中草藥，常用于治療瘀血腫痛、跌打損傷、肌肉痙攣、精神分裂等疾病[1-2]。上世紀80年代我國科學家首次從蛇足石杉中分離出石杉堿甲 (Huperzine A)，后經研究證明是一種高效、可逆、選擇性強的乙酰膽堿酯酶抑制劑，治療老年癡呆癥 (Alzheimer's disease, AD) 療效顯著，而且具有毒性低、生物利用率高、易穿透血腦屏障、藥效長等優點[2-4]。……