一種基于核酸外切酶Ⅲ的PCR產物克隆方法

王艷艷，張春雨，王興春，劉斌

1 山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801

2 中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081

3 山西農業大學研究生院，山西 太谷 030801

一種基于核酸外切酶Ⅲ的PCR產物克隆方法

王艷艷1,2,3*，張春雨2*，王興春1，劉斌2

1 山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801

2 中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081

3 山西農業大學研究生院，山西 太谷 030801

基因克隆作為一種常規技術被廣泛應用于DNA及蛋白質的研究。在傳統的基因克隆中，一般利用限制性內切酶對DNA片段進行消化，然后使用DNA連接酶完成連接，因此這種方法受到插入片段和載體酶切位點的限制。一些ligase-free 克隆技術雖然克服了酶切位點的限制，但費時費力，成本較高。為了彌補其他ligase-free技術的不足，文中介紹了一種新的利用核酸外切酶Ⅲ進行ligase-free克隆的方法，反應時間僅需要30 min，提高了克隆效率并有效降低經濟成本，有利于大規模基因克隆的應用。

核酸外切酶Ⅲ，LIC系統，PCR產物克隆

為了提高克隆效率，近年來一些ligase-free技術已經被開發用于高效克隆PCR產物，包括GATEWAY系統[1-3]、In-fusion系統[4-6]、尿嘧啶DNA糖基化酶 (Uracil-DNA glycosylase，UDG)[7-9]、序列和連接反應的高效克隆基因方法(Sequence-ligation independent cloning，SLIC)[10]，以及基于T4 DNA 聚合酶的連接反應克隆(Ligation-Independent cloning，LIC)[11-15]等。但它們依然存在一些缺陷，例如GATEWAY系統操作步驟繁瑣，引物的兩端需加入較長特定序列，反應所需的酶類價格昂貴，并需要特定的載體[10]。In-fusion雖然反應條件簡單，效率較高，但昂貴的酶讓人望而卻步，在大規模的克隆中消耗太大。LIC作為一種快速高效的方法被應用于大規模的基因克隆[16]及載體構建[17-19]。……