蛋白激酶D1催化結構域在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統內的表達、純化和活性測定

李志紅，Qiming Jane Wang

1 三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D1催化結構域在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統內的表達、純化和活性測定

李志紅1,2，Qiming Jane Wang2

1 三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D (Protein kinase D, PKD) 是一種新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受體，參與細胞內多種生理生化過程。為獲得高純度的PKD1的催化結構域 (PKD1-cat)用于晶體學結構的研究，將帶有GST標簽的PKD1-cat基因克隆到桿狀病毒轉移載體pFastBac1中，構建了重組質粒。將重組質粒轉化到含穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態細胞中，轉座后獲得了含目的基因GST-PKD1-cat的重組Bacmid。重組Bacmid DNA轉染Sf9昆蟲細胞后，獲得重組桿狀病毒并擴毒。將毒種以5 PFU/cell的感染復數感染懸浮培養的T.ni昆蟲細胞，SDS-PAGE和Western blotting檢測表達產物。結果顯示，表達產物在分子量約68 kDa處有一特異條帶可與GST單克隆抗體發生反應。經谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化和 PreScission Protease 切除GST標簽后，得到了純度很高的分子量約42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。體外PKD激酶活性實驗結果顯示，隨著PKD1-cat濃度的增加，激酶活性增高。這些結果顯示截短的重組PKD1-cat有很高的催化活性和純度，為采用核磁共振或晶體學方法解析PKD1-cat的三維結構奠定了基礎。

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蛋白激酶D (Protein kinase D，PKD) 是一種新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受體，能傳遞G蛋白偶聯受體或酪氨酸激酶受體的信號[1]。目前已鑒定的PKD家族成員有3個：PKD1、PKD2和PKD3。3種PKD亞型都包含N端的調節結構域和C端的催化結構域。N端調節域內有幾個保守的模體：丙氨酸-脯氨酸富集的非極性區域、富含半胱氨酸的DAG結合結構域、酸性結構域和可能參與催化活性抑制調節的普列克底物蛋白同源域[2-3]。……