肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達

張存亮，聶福平，王昱，楊俊，李應國，蔡家利

(1.重慶理工大學，重慶 400060;2.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，重慶 400020;3.重慶大學，重慶 400030)

肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達

張存亮1，2，聶福平2，3，王昱2，3，楊俊2，李應國1，蔡家利2

(1.重慶理工大學，重慶 400060;2.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，重慶 400020;3.重慶大學，重慶 400030)

克隆了肺炎嗜衣原體外膜主蛋白(major out membrane protein，MOMP)基因，并進行了原核表達。根據GenBank公布的肺炎嗜衣原體MOMP基因序列，設計克隆引物后用普通PCR方法擴增出肺炎嗜衣原體MOMP基因的完整片段，將其克隆到pMD－19T后進行測序，經序列比對正確后將此片段亞克隆到表達載體pET－32a(+)中，轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，經IPTG誘導表達，再采用SDS－PAGE和Western－Blot檢測重組蛋白的表達情況。結果表明:本研究克隆了肺炎嗜衣原體MOMP基因并在原核系統中成功表達了MOMP重組蛋白，且Western－Blot顯示該重組蛋白具有免疫學活性。

肺炎嗜衣原體;MOMP基因;克隆;原核表達

肺炎嗜衣原體(chlamydophila pneumoniae，Cpn)是衣原體科下嗜衣原體屬的一種嚴格細胞內寄生致病微生物，可引起人的非典型性肺炎、支氣管炎、咽喉炎等呼吸系統疾病。另外，有研究表明，肺炎嗜衣原體感染與心血管疾病相關，例如冠心病、擴張型心肌病等。尤其是它在動脈粥樣硬化形成過程中的作用受到了國內外學者的高度關注［1］。目前，肺炎嗜衣原體已被列為對中國人衛生健康有重大影響的十二種病原微生物之一。

MOMP是肺炎嗜衣原體外膜蛋白的主要成分，占外膜蛋白總量的60%以上。通過對外膜主蛋白的研究，發現其不僅在肺炎嗜衣原體黏附宿主細胞的過程中起重要作用，而且本身也是一種重要的抗原，能刺激機體產生免疫應答［2］。

本研究通過對肺炎嗜衣原體MOMP基因進行克隆，構建了原核表達載體，并在大腸桿菌中高效表達，然后對重組蛋白進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 載體及菌株

肺炎嗜衣原體菌株AR－39，購自美國菌種保藏中心;克隆載體pMD－19T，購自寶生物工程(大連)有限公司;原核表達載體pET－32a(+)、大腸桿菌Rosetta(DE3)，均購自默克密理博;大腸桿菌DH5α，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶SalⅠ、NotⅠ，均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒(50)、質粒提取試劑盒(100)為OMEGA產品;Western－Blot實驗所用二抗、HRP標記的兔抗鼠IgG、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒，購自生工生物工程(上海)有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為Roche公司產品。

1.3 引物的設計與合成

將GenBank中登記的肺炎嗜衣原體基因全序列及其MOMP基因序列下載并通過軟件MEGA5.1進行比對，設計合成了1對克隆引物和1對表達引物。

克隆上引物:5’－GTCGCCAAAATATGAGTAATAGCG－3’;克隆下引物:5’－ACAAGGTGAGGAGAAATTCTAAGC－3’。表達上引物:5’－ACGCGTCGACTTATGAAAAAACTCTTAAAG－3’(下劃線為引入的SalⅠ酶切位點);表達下引物:5’－ATTT GCGGCCGCGAATCTGAACTGACCAGA－3’(下劃線為引入的NotⅠ酶切位點)。以上引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 MOMP基因的PCR擴增

PCR擴增反應體系:反應總體積是25 μL。其組成包括:10×Ex Taq Buffer(Mg Free)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL，25 mmol/L MgCl22μL，上下游克隆引物各0.5 μL，Taq聚合酶(5 U/ μL)0.125 μL，超純水14.875 μL，模板2.5 μL。

反應條件:94.0℃預變性3 min;而后35個循環，循環程序為:94.0℃變性30 s，53℃退火30 s，72.0℃延伸1 min;72.0℃再延伸5 min;18℃保存。反應結束后，將PCR產物跑瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后使用膠回收試劑盒回收產物。

1.5 基因的克隆與鑒定

將PCR產物與克隆載體pMD－19T連接，按照常規方法［3］連接后轉入DH5α感受態細胞，通過氨芐青霉素抗性進行篩選和PCR擴增進行鑒定;所得陽性克隆送寶生物工程(大連)有限公司測序，將獲得的陽性重組質粒命名為pMD－19TMOMP。測序結果通過一系列軟件比對，得到正確的肺炎嗜衣原體菌株AR－39的MOMP基因序列，并上傳至美國國立生物技術信息中心(NCBI)，得到的序列號為GenBank KC512913，以方便后續實驗及文章引援。

1.6 表達載體的構建

使用上下游表達引物，參照1.4節的PCR擴增體系和擴增條件對pMD－19T－MOMP進行擴增，得到的PCR擴增產物用膠回收試劑盒進行回收。對回收的pMD－19T－MOMP和pET－32a(+)載體質粒分別進行SalⅠ和NotⅠ雙酶切，膠回收后用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接產物轉化至DH5α感受態細胞。提取陽性質粒經PCR和雙酶切鑒定正確后，將重組質粒命名為pET－32a－MOMP。再轉化至大腸桿菌Rosseta(DE3)中，提取質粒鑒定后，送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.7 重組蛋白的誘導表達

將含重組質粒pET－32a－MOMP的Rosseta (DE3)接種于含氨芐青霉素抗性的營養肉湯培養液中，放在37℃、130 r/min搖床振蕩過夜。取過夜培養物以體積比1∶100接種到新鮮的含氨芐青霉素抗性的營養肉湯中，搖菌至OD600值為0.6～0.8時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/ L，收集細菌。4℃、12 000 r/min離心5 min，進行SDS－PAGE分析。

1.8 重組蛋白的可溶性分析及Western-Blot鑒定

按照超聲破碎法對菌體進行超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀制樣并進行SDS－PAGE分析。Western－Blot鑒定:將上述重組蛋白純化后制蛋白樣進行SDS－PAGE電泳，轉移到PVDF膜上進行Western－Blot實驗。一抗是小鼠的陽性血清，稀釋倍數是1∶1 000;二抗是辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，稀釋倍數是1∶2 500。最后，按照辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒操作說明書進行顯色及終止反應。

2 實驗結果

2.1 目的基因PCR擴增

經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增出1條約1 200 bp的特異性條帶(見圖1)，與預期的目的片段大小基本一致。

圖1 MOMP基因的PCR擴增

2.2 重組質粒pMD-19T-MOMP的鑒定

重組質粒經PCR擴增后進行凝膠鑒定，結果得到1條約1 200 bp的條帶(見圖2)，與預期的片段長度一致。將陽性質粒送寶生物公司測序。此序列通過軟件處理后刪除克隆載體序列，得到MOMP基因序列。在美國國立生物技術信息中心中比對，結果一致率為99%。

圖2 重組質粒pMD－19T－MOMP的PCR鑒定

2.3 重組表達質粒pET-32a-MOMP的PCR和雙酶切鑒定

重組表達質粒pET－32a－MOMP經表達引物的PCR擴增得到1條約1 200 bp條帶，與預計結果相符;pET－32a－MOMP經T7引物的PCR擴增得到1條約2 000 bp條帶，與預計結果相符;pET－32a－MOMP經SalⅠ和NotⅠ雙酶切，得到兩條帶，一條約5 900 bp，另一條約1 200 bp，與預計結果相符。

圖3 重組質粒pET－32a－MOMP的雙酶切和PCR鑒定

2.4 SDS-PAGE分析

重組質粒pET－32a－MOMP經IPTG誘導后，在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進行表達。表達蛋白的分子質量約56 kDa，與預期的相對分子質量相符(見圖4)。

圖4 重組菌的誘導表達

2.5 可溶性分析

重組質粒pET－32a－MOMP經IPTG誘導表達后，用超聲破碎法將菌液破碎。經分析，該重組蛋白多以包涵體的形式存在。

2.6 蛋白質印跡實驗(Western-Blot)鑒定

經IPTG誘導表達的重組蛋白按常規方法純化后經SDS－PAGE分析，用半干法轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入已稀釋的一抗和二抗進行孵育，最后使用顯色試劑盒進行顯色。結果顯示(見圖5):在56 kDa處有1條蛋白印跡帶，表明該重組蛋白具有免疫學活性。

圖5 表達產物的Western－Blot分析

3 討論

肺炎嗜衣原體中編碼MOMP的基因開放閱讀框有1 167 bp，MOMP由366個氨基酸殘基組成，分子質量約40 kDa，MOMP包含4個可變區和5個保守區［4］。MOMP具有高度的保守性，不同菌株MOMP的基因序列是一致的，說明肺炎嗜衣原體可能只有一種基因型。該實驗克隆的MOMP基因全序列通過與GenBank公布的肺炎嗜衣原體MOMP基因序列比對，顯示結果一致率為99%。

肺炎嗜衣原體中的MOMP蛋白可刺激機體產生強烈的保護性免疫，是機體體液免疫反應的主要目標，因其含有血清特異性中和抗體決定簇，故在引起免疫反應中起關鍵作用。肺炎嗜衣原體的MOMP是感染過程中引起機體免疫應答的重要免疫原，成為Cpn檢測試劑的主要候選抗原之一。

4 結論

本文通過分子生物學方法成功克隆了肺炎嗜衣原體MOMP全長基因，并成功原核表達了MOMP重組蛋白。該重組蛋白經蛋白質印跡實驗鑒定具有免疫學活性，可作為抗原免疫小鼠，制備單克隆抗體，為進一步研究肺炎嗜衣原體ELISA檢測試劑盒的組裝提供參考。

［1］Ramirez J A.Isolation of Chlamydia pneumoniae from the coronary artery of a patient with coronary atherosclerosis［J］.Ann Intern Med，1996，125，979－982.

［2］Wolf K，Fischer E，Mead D，et al.Chlamydia pneumoniae major outer membrane protein is a surface－exposed antigen that elicits antibodies primarily directed against conformation－dependent determinants［J］.Infect Immun，2001，69，3082－3091.

［3］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆試驗指南［M］.黃培堂，等，譯.北京:科學出版社，2002.

［4］Baghian A，Shaffer L，Store J，et al.Antibody response to epitopes of chlamydial major out membrane proteins on infectious elementary bodies and of the reduced polyacrylamide gel electrophoresis separated form［J］.Infect Immun，1990，58(5):1379－1383.

(責任編輯 何杰玲)

Cloning and Prokaryotic Expression of the MOMP Gene of Chlamydophila Pneumoniae

ZHANG Cun－liang1，2，NIE Fu－ping2，3，WANG Yu2，3，
YANG Jun2，LI Ying－guo1，CAI Jia－li2
(1.Chongqing University of Technology，Chongqing 400060，China;
2.Chongqing CIQ，Chongqing 400020，China;
3.Chongqing University，Chongqing 400030，China)

The MOMP complete gene of chlamydophila pneumoniae was cloned and expressed in prokaryotic expression system.The MOMP complete gene of Chlamydophila pneumoniae was amplified by normal PCR with designed cloning primers based on the reported in GenBank.The amplified MOMP complete gene was inserted into the cloning vector pMD19－T and then was sequenced.The correct MOMP gene was sub－cloned into expressed vector pET－32a(+)for prokaryotic expression in Rosetta (DE3)induced by IPTG.The MOMP gene was cloned and was submitted to NCBI.The recombinant proteins were expressed successfully in prokaryotic expression system.Western－Blot showed that the recombinant protein has antigenicity.

chlamydophila pneumoniae;MOMP gene;clone;prokaryotic expression

Q31

A

1674－8425(2014)04－0068－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.04.015

2013－10－21

國家質檢總局科技項目(2010IK030)

張存亮(1982—)，男，重慶墊江人，碩士研究生，主要從事疫苗及診斷技術研究。

張存亮，聶福平，王昱，等.肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014(4):68－71.

format:ZHANG Cun－liang，NIE Fu－ping，WANG Yu，et al.Cloning and Prokaryotic Expression of the MOMP Gene of Chlamydophila Pneumoniae［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014 (4):68－71.