MicroRNA-100在胃癌患者血清中的表達及臨床意義

王利平 王啟之 鄧 敏 燕善軍 汪建超 李大鵬 汪強武

MicroRNA-100在胃癌患者血清中的表達及臨床意義

王利平 王啟之 鄧 敏 燕善軍 汪建超 李大鵬 汪強武

目的：探討MicroRNA-100（miR-100）在胃癌患者血清中的表達及臨床意義。方法：選擇蚌埠醫學院第一附屬醫院手術及隨訪資料完整的胃癌患者（40例）和健康對照者（40例）為研究對象，提取血清總miRNA，在建立了穩定、敏感的血清miR-100絕對定量檢測方法（qRT-PCR）的基礎上，檢測胃癌和健康對照者血清中miR-100表達水平。分析胃癌和健康對照者血清中miR-100表達差異及血清中miR-100表達水平與胃癌臨床病理參數的關系。結果：胃癌患者血清中miR-100的表達水平為（2.78±1.92）fmol/L，顯著高于健康對照者［（0.19±0.15）fmol/L，P＜0.01］，同時miR-100的受試者工作特征曲線顯示，血清miR-100對胃癌診斷具有良好的特異度和敏感度（曲線下面積0.985）；進一步分析發現：血清中miR-100的表達與性別、年齡、腫瘤直徑大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移數量、TNM分期等無明顯差異（P＞0.05）。結論：血清miR-100的檢測可能有助于胃癌的診斷。

MicroRNA miR-100 腫瘤標記物 胃腫瘤 敏感性與特異性

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居全部惡性腫瘤的第二位［1］。2008年調查顯示大約每年有98.9萬新發病例，73.8萬死亡病例。超過70%的病例（約每年71.4萬例）在發展中國家，大約有50%的胃癌發生在亞洲東部［2］。究其原因，主要是胃癌患者就診時，大多數已經處于中晚期，耽誤了最佳治療時機，預后較差。目前臨床中常用于胃癌檢測的腫瘤標記物有CEA、CA199等，但敏感度和特異性均不能令人滿意，很多學者想到聯合檢測多種腫瘤標記物，但結果仍不理想［3］。所以亟待尋找一種特異、敏感的胃癌血清生物標志物來提高胃癌的早期診斷、改善胃癌患者預后。

微小核糖核酸（miRNA）是近年來新發現的一種腫瘤標志物，與腫瘤的發生發展密切相關。研究發現，miRNA不僅在腫瘤組織中表達異常，在腫瘤患者血清中也能穩定存在［4-7］。前期研究發現，miR-100在胃癌中表達較癌旁組織中明顯升高，本研究旨在探討miR-100在胃癌患者血清中的表達變化及與臨床病理參數的關系，有助于胃癌的早期診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 40例胃腺癌患者血清標本均來自蚌埠醫學院第一附屬醫院2013年6月至2013年11月住院患者，均經術后病理證實為胃腺癌。收集標本前患者均未接受放射治療和化學藥物治療。其中男性27例，女性13例；年齡38～82歲，平均（63.03± 11.39）歲；臨床分期按2010年國際抗癌聯盟（UICC）TNM標準分期：Ⅰ/Ⅱ期20例，Ⅲ/Ⅳ期20例；病理分級：高、中分化為18例，低分化為22例；N0/N1共17例，N2/N3共17例。40例健康對照組血清標本來自健康體檢者。本研究經蚌埠醫學院倫理委員會批準，所有標本均獲知情同意書。

1.1.2 血液標本收集 用無菌注射器抽取患者靜脈血5 mL，注入離心管中，常溫放置60 min，2 h內血清的離心完成，4℃，2 000 r/min，離心10 min，吸取上層血清轉入無RNA酶的1.5 mL EP管中，冷凍于-80℃冰箱。同時收集患者的臨床及隨訪資料用于病理參數的分析。

1.1.3 試劑 血清miRNA快速提取試劑盒試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，miRNA逆轉錄試劑盒，universal master mix，miRNA探針購自美國生命科技公司。

1.2 方法

1.2.1 血清中總miRNA的提取 參考血清miRNA快速提取試劑盒試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）的使用說明書提取血清總miRNA。

1.2.2 逆轉錄反應 參照TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，反應條件如下：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，程序結束后即miRNA的逆轉錄完成。

1.2.3 絕對定量PCR（qRT-PCR） 參照絕對定量PCR反應試劑盒說明書對miR-100進行絕對定量檢測，用化學合成的has-miR-100作為標準品進行10倍的梯度稀釋，制作標準曲線。Real-time PCR程序：95℃10 min，95℃5 s，60℃1 min，設置為40個循環。擴增反應在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，實時熒光定量PCR擴增反應每個樣本均做復管，重復3次，取平均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，用配對樣本的t檢驗分析比較miR-100在胃癌患者和健康對照者血清中的表達差異，用兩獨立樣本的t檢驗或者單因素方差分析比較血清miR-100表達水平與胃癌臨床病理參數間的關系，用受試者工作特征曲線（ROC）計算并評價血清miR-100作為胃癌診斷分子標記的特異度和敏感度。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miR-100絕對定量檢測方法

將人工合成的has-miR-100制備成濃度分別為10-2、l0-1、100、101、102、103、l04、l05、l06fmol/L的標準反應樣本，分別進行逆轉錄反應及RT-PCR反應，記錄不同濃度樣本的CT值，以濃度對數值為X軸，CT值為Y軸作散點圖，線性擬合，得出線性方程為Y=-3.259log X+33.777（R2=0.9880），從而建立了穩定、敏感的血清miR-100絕對定量PCR檢測體系。

2.2 胃癌患者組血清miR-100與健康對照組比較

用上述定量檢測方法對40例胃癌患者組和40例健康對照組血清中miR-100的表達水平進行了檢測。結果表明，胃癌患者組血清miR-100平均濃度較健康對照組高，胃癌組與健康對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01，表1）。

表1 胃癌組和健康對照組血清中miR-100的表達差異Table 1 Differential expression of miR-100 in the serum of gastric cancer patients and healthy controls

2.3 血清miR-100表達水平與胃癌臨床病理參數的關系

通過比較發現分化程度越低以及有淋巴結轉移的患者，miR-100的表達量較高，但均無顯著性統計學差異（P＞0.05）。進一步分析發現miR-100與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、直徑大小、臨床TNM分期等無相關性（P＞0.05，表2）。

2.4 血清中miR-100、CEA、CA199診斷胃癌可靠性的比較

受試者工作曲線（ROC曲線）分析顯示：血清中各檢測指標診斷胃癌的曲線下面積（AUC）從小到大依次分別為CA199、CEA、miR-100，結果分別為0.729、0.814、0.985。診斷胃癌的最佳miR-100濃度截斷值為0.48 fmol/L，其靈敏度和特異性分別為95%、97.5%（圖1，表3）。

表2 miR-100的表達水平與臨床病理參數之間的關系Table 2 Relationship between miR-100 expression and the clinicopathologic parameters

圖1 miR-100與CEA、CA199診斷胃癌的ROC曲線比較Figure 1 Comparison of miR-100 levels with the Receiver Operating Characteristic curves of CEA and CA199 for the diagnosis of gastric cancer

表3 CEA、CA199、miR-100診斷胃癌曲線下面積（AUC）差異Table 3 Differences of the area under curves among the CEA,CA199, and miR-100 for the diagnosis of gastric cancer

3 討論

miRNA是新近發現的長約19～25 nt的內源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核細胞中，它的發現揭示了一種新的基因表達調控方式。近年大量的研究發現，血漿中的miRNA很早就被用作于腫瘤生物診斷標記物［8］。Mitchell等［9］研究發現，miRNA能夠在外周血中穩定存在，同時認為正常情況下血清中的miRNAs來自血細胞，而與腫瘤相關的miRNAs并非來源于血細胞，可能來自腫瘤組織。進一步研究指出，miR-141在前列腺癌患者血清中較對照組明顯升高，并且與前列腺抗原密切相關，以miR-141作為腫瘤標記物診斷前列腺癌的敏感度和特異性（60%、100%）。

Mourelatos等［10］通過基因測序首先發現成熟miR-100在人類的基因序列為“AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG”22個堿基，并定位于11號染色體。miR-100是人類發現較早miRNA中的一員，在多種腫瘤組織和細胞中表達異常［11-16］。Volinia等［17］在對胃癌等6種人類腫瘤的540例組織標本的研究發現，相對于正常胃黏膜組織，miR-100在胃癌組織中表達上升。Ueda等［18］也發現miR-100在胃癌中明顯升高，起到促癌基因的作用。前期研究也證實了miR-100在胃癌組織中是明顯上調的。

本研究發現，與健康者相比，胃癌患者血清miR-100的表達明顯升高，發現分化程度越低的患者，miR-100的濃度越高，但都無統計學意義（P＞0.05）。推測可能與miRNA表達特異性或者是樣本量較少有關。ROC曲線分析指出，診斷胃癌的最佳miR-100濃度截斷值為0.48 fmol/L，其靈敏度和特異度分別為95%與97.5%，曲線下面積0.985，說明血清miR-100對胃癌診斷具有良好的特異性和敏感性。

本實驗中觀察到胃癌組織中高表達的miR-100，同時患者血清中miR-100也高表達，另外由于血清miRNA的穩定性［9］，加之取材方便，這使得miR-100的血液檢測成為可能。但臨床廣泛應用還有很多問題需要解決，如血清miR-100是否可以作為診斷胃癌的腫瘤檢測指標；建立適合臨床應用的標準化檢測體系，包括質控和診斷閾值的確定；以及能否與其他血清腫瘤標志物聯合檢測以提高胃癌檢測的敏感性和特異性，這些都有待于基礎研究中組織特異性的miRNAs的發現以及更大樣本的臨床研究。

總之，與腫瘤相關的miRNA的研究仍處于初級階段，隨著研究的進一步深入，外周血miR-100的檢測有望成為胃癌診斷以及預后評價的重要指標。

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（2014-05-18收稿）

（2014-10-25修回）

（本文編輯：賈樹明）

Expression and clinical significance of serum microRNA-100 in gastric cancer patients

Liping WANG,Qizhi WANG,Min DENG,Shanjun YAN,Jianchao WANG,Dapeng LI,Qiangwu WANG

Department of Gastroenterology,The FirstAffiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233000,China

Qizhi WANG;E-mail:wangqz2004@sina.com

Objective:To investigate the expression of microRNA-100(miR-100)in the serum of gastric cancer patients and its clinical significance.Methods:At The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,40 gastric cancer patients who underwent surgery with complete follow-up data and 40 healthy controls were selected as research subjects.Total miRNA was isolated from the serum samples of the cancer patients.A stable and sensitive detection method for the absolute quantification of miR-100 was established. The serum levels of miR-100 in the patients and healthy controls were tested according to this novel method.Differences of the miR-100 expression in the serum samples of the patients and healthy controls were analyzed using statistical analysis.The correlation between miR-100 expression levels and the clinicopathological features of gastric cancer was also analyzed.Results:The expression level of miR-100 in the serum was significantly higher in cancer patients［(2.78±1.92)fmol/L］than in the healthy controls［(0.19± 0.15)fmol/L,P＜0.01］.The receiver operating characteristic curve of miR-100 indicated that serum miR-100 has satisfactory specificity and sensitivity for the diagnosis of gastric cancer(AUC=0.985).Further analytical results indicated that no significant differences were found among the expression levels of serum miR-100 with respect to the gender,age,tumor diameter,infiltrating depth,differentiation degree,frequency of lymph-node metastasis,and TNM stage(P＞0.05).Conclusion:Serum miR-100 testing may be helpful in the diagnosis of gastric cancer.

MicroRNA,miR-100,tumor marker,stomach neoplasm,sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-8179.20140777

蚌埠醫學院第一附屬醫院消化內科（安徽省蚌埠市233004）

王啟之 wangqz2004@sina.com

王利平 專業方向為消化腫瘤內科的臨床治療和研究。

E-mail：wangliping3785@126.com