匍枝根霉液態發酵產木聚糖酶培養基優化研究

湯文晶，謝志皓，張慶慶，鄭天柱，真 超

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

研究利用農副產品為主要碳源，液態發酵產木聚糖酶，提高農副產品的利用率.木聚糖酶［1－2］是指能夠降解半纖維素木聚糖生成木寡糖和木糖的一組酶的總稱，主要是由β－1，4－D－內切木聚糖酶和β－1，4－D－外切木糖苷酶組成.隨著微生物工程技術的發展，國內外利用不同菌種來發酵產木聚糖酶.國內主要以黑曲霉、里氏木霉及綠色木霉為生產菌株，通過不同的誘導物誘導和發酵工藝的優化產生木聚糖酶，獲得較高的產量，并應用于食品及工業；國外通過基因工程技術獲得木聚糖酶基因，Dorra Driss等［3－5］通過提取青霉菌中的木聚糖酶基因，通過異源表達以及分離純化，獲得純酶，César Rafael利用甘蔗渣、木薯片等優化培養基，獲得較高的酶活.木聚糖酶的應用領域不斷擴大，除了在造紙和紙漿工業領域外［6］，木聚糖酶作為面包烘焙添加劑，可改善面包的彈性和硬度［7］；添加木聚糖酶有助于小麥啤酒的過濾，增加啤酒酒香［8］等.

利用TP－02匍枝根霉亞種點頭根霉，采用深加工農副產品為主要碳源，以成本低廉、來源豐富的玉米芯和麥麩作為原料，采用微生物液態發酵方式生產木聚糖酶，通過單因素實驗，確定影響木聚糖酶酶活的主要因素和添加量，根據Box－Behnken實驗設計原理，進行響應面分析實驗，并借助Design Expert 8.0.5軟件進行數據分析，確定最佳的發酵培養基，經過實驗驗證，木聚糖酶酶活得到較大提高，利用此方法生產木聚糖酶作為食品添加劑，為低成本利用生物質資源技術提供有利依據.

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

匍枝根霉亞種點頭根霉（Rhizopus stolonifer var.reflexus TP－02），分離自黃山生態林腐木.木聚糖：樺木木聚糖（Sigma）；其他試劑均為國藥分析純.

1.2 培養基和培養方法

菌種活化：將匍枝根霉亞種點頭根霉在PDA斜面上30℃培養3～5d，4℃保存備用.

種子液培養：將活化好的菌株用無菌水洗下孢子用玻璃珠分散菌落，接入100mL 10%麥麩浸出汁（體積250mL三角搖瓶中）的種子培養基中，培養溫度30℃，搖床轉速為180r/min，恒溫培養24h.

發酵基礎培養基：麥麩4g，（NH4）2SO40.2g，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.2%，吐溫－80 0.025%，微量元素液1%，滅菌后接種，在30℃，180r/min培養.

1.3 試劑配制及木聚糖酶測定方法

木糖標準液配制：配制濃度為1mg/mL.1%的木聚糖水解底物：取1%木聚糖用0.2mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）溶解；微量元素液：FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2.DNS顯色液、木糖標準曲線的制作、木聚糖酶酶的測定方法參照文獻［9］，以每分鐘每毫升酶液釋放1umol木糖的量為1個酶活力單位（U·mL－1）.酶活計算公式：（X·103）/（M·T·V）IU/mL.其中，X為標準曲線中的含糖量，mg；M為相對分子質量（木糖的相對分子質量為150.13）；T為反應時間，min；V為粗酶液體積，mL.

1.4 單因素實驗

以農副產品下腳料為碳源；以 NaNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、CO（NH2）2為氮源；以 KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、Na2HPO4、FeSO4、MnSO4為無機鹽；以SDS和吐溫－80作表面活性劑；其他因素不變做單因子實驗，通過實驗研究確定最佳的碳源、氮源、無機鹽表面活性劑及添加量.

1.5 Plackett－Burman實驗

通過前期的單因素試驗研究，確定匍枝根霉的影響因素為：X1，麥麩玉米芯粉混合添加量（4，6）；X2，（NH4）2SO4（0.4，0.6）；X3，KH2PO4（0.2，0.3）；X4，MgSO4·7H2O（0.2，0.3）；X6，CaCl2（0.4，0.6）；X8，吐溫 －80（0.07，0.105）；X10，微量元素液（1，1.5）；X5，X7，X9，X11，空項（－1，1），設計PB實驗，以木聚糖酶酶活為響應值，用Design Expert軟件對實驗數據進行分析（括號內數字為PB實驗低水平和高水平）.

1.6 最陡爬坡實驗

通過PB實驗，確定發酵培養基0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O2，0.4%無水CaCl，1%的微量元素液，100mL的裝液量，10%的接種量，選定麥麩玉米芯粉混合添加量、（NH4）2SO4、吐溫－80 3個關鍵因素進行最陡爬坡實驗.

1.7 Box－Behnken實驗

由最陡爬坡實驗可知，根據最陡爬坡實驗2的條件為中心點，利用Design Expert軟件設計響應面實驗，因素及水平表如表1所示.

表1 Box－Behnken響應面實驗因素水平表

1.8 驗證試驗

為檢驗響應面法回歸方程預測是否可靠，采用響應面最佳培養基進行發酵培養，即：3.9%麥麩玉米芯，0.35%（NH4）2SO4，0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O，0.4%CaCl2，0.06%吐溫－80，1%的微量元素液，裝液量為100mL，pH自然，接種量為10%，在30℃，180r/min的搖床下培養.通過5次平行試驗來確定培養基的可信度.

2 結果與分析

2.1 標準曲線確定及單因素試驗結果

圖1 木糖在520nm處標準曲線

木糖在520nm處標準曲線如圖1所示.通過碳源對酶活影響分析，當以麥麩：玉米芯粉混合碳源為4%時，其產酶達到59.032U/mL；通過碳源的研究，確定（NH4）2SO4為最佳氮源，添加量為0.4%，產酶最高達55.322U/mL；通過無機鹽的研究，當KH2PO4，MgSO4，CaCl2的添加量為0.2%時，其產酶達到61.970U/mL；通過表面活性劑對酶活影響的研究，添加吐溫－80為0.07%時，其產酶達到68.974U/mL.

2.2 PB試驗結果

根據1.6實驗設計，通過軟件設計及實驗，Plackett－Burman試驗設計結果如表2所示，其方差分析如表3所示，得到木聚糖酶酶活為響應值的線性回歸方程：Y＝63.86－8.63＊X1－4.81＊X2＋0.51＊X3－1.06＊X4－2.53＊X6－3.15＊X8－2.33＊X10.從各變量的系數可以看出，麥麩玉米芯粉混合添加量（X1），（NH4）2SO4（X2），MgSO4·7H2O（X4），無水 CaCl2（X6），吐溫 －80（X8），微量元素液（X10），呈負效應，在后續實驗中應取低水平；KH2PO4（X3）呈正效應，在后續實驗中應增加其含量.方差分析模型的Prob（P）＞F值為0.002 4，該模型相關系數R2＝0.982 2，修正決定系數實驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋；表明所得回歸方程達到極顯著，即該模型在被研究的整個回歸區域擬合很好.通過顯著性研究，X1，X2，X8對木聚糖酶產量影響較大，通過爬坡實驗和響應面實驗進行優化研究.

表2 Plackett－Burman試驗設計及結果

表3 影響因素的顯著性分析

2.3 最陡爬坡實驗結果

最陡爬坡實驗設計及實驗結果如表4如示.由表4可知，木聚糖酶的產量隨著關鍵因素變化而變化，產量最高值出現在第2組，達到89.288U/mL，說明此時麥麩玉米芯粉的混合碳源、（NH4）2SO4、吐溫－80的濃度最高值接近最優，故選擇第2組作為中心點，進一步對培養基進行優化.

表4 最陡爬坡實驗設計及實驗結果

表5 Box－Behnken實驗設計及結果

Box－Behnken實驗設計及結果如表5所示.以木聚糖酶酶活為響應值，對表5中的實驗結果進行二次回歸分析，得到的回歸方程：Y＝108.92＋3.9＊X1－1.6＊X2－2.24＊X3＋0.92＊X1X2－3.89＊X1X3＋回歸方程的方差分析如表6所示.該模型極顯著，即Pr＞F值＜0.0001.在該模型各參數中，X1對木聚糖酶產量有較顯著的影響，即麥麩玉米芯粉混合碳源是對實驗結果影響較大的因子對木聚糖酶的產量影響也達到顯著水平，說明（NH4）2SO4，吐溫－80對木聚糖酶產量的影響也是二次關系.該模型相關系數R2＝0.9802，修正決定系數表明該模型預測值和實測值擬合良好，可以很好地解釋響應值的變化.

表6 Box－Behnken回歸方程的方差分析

用Design expert 8.0.5軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面立體分析圖和等高線圖（見圖2）.由圖2及軟件分析可知，回歸方程存在穩定點.通過分析可知，X1，X2，X3的編碼值分別為3.9%，0.35%，0.06%，即麥麩玉米芯粉混合碳源，（NH4）2SO4，吐溫－80的含量，此條件下預測得到木聚糖酶酶活為102.221U/mL.

圖2 響應面法三維曲面和等高線圖

2.4 驗證試驗

在最優條件下，通過5次平行試驗，所得木聚糖酶平均酶活為101.697U/mL，方差分析如表7所示.與預測值相比，相對誤差在1%以內，這表明響應面法擬合的方程可以用于預測實際的木聚糖酶產量.

表7 平行試驗方差分析

3 結果與討論

木聚糖酶在飼料、食品、紡織等諸多領域得到應用，玉米芯粉和麥麩是農業的副產物，具有較秸稈類半纖維素相對豐富，成本低來源廣的特點，是一種生產畜牧飼料添加劑的重要發酵碳源.吐溫－80具有低毒性的特點，適量的添加有助于酶的分泌.本研究篩選的匍枝根霉具有較高的木聚糖酶酶活，利用響應面法進行培養基優化，回歸方程精確度高，使培養基優化更加合理性和科學性.

本研究利用響應面法優化匍枝根霉產木聚糖酶培養基，提高該菌株的產酶量.在單因素水平試驗的基礎上，結合PB設計試驗及響應面分析，對各因素進一步優化，最終確定最佳發酵培養基為：3.9%麥麩玉米芯粉混合碳源，0.35%（NH4）2SO4，0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4·7H2O，0.4%CaCl2，0.06%吐溫－80，1%的微量元素液，pH自然，液體培養.在30℃，180r/min的搖床下培養.木聚糖酶酶活可達到101.696 3U/mL，其產量比優化前提高了3.5倍，得到了較高的木聚糖酶酶活，優于文獻報道的匍枝根霉產木聚糖酶酶活.

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