含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的質量評價

王炎+宋大遷+王青+范忠澤+李琦

[摘要] 目的 探討丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的制備及其質量評價。 方法 采用乳化溶劑蒸發法制備丹參酮ⅡA多級納米粒；測定丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的粒徑分布及納米微粒表面結構；并檢測丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的載藥量、包封率及體外藥物釋放規律。 結果 課題組制備的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，大小均勻，載藥納米粒的平均粒徑為190nm，Zeta電位為4.3mV，包封率（94.12±5.20）%，載藥量（2.05±0.12）%。與游離的丹參酮ⅡA單體相比，丹參酮ⅡA多級靶向納米粒釋放速度明顯減慢，在120h累積釋放量為72.59%。 結論 采用乳化溶劑蒸發法成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒。與丹參酮ⅡA單體相比，制備成納米制劑后，多級靶向載藥納米粒能隨著時間的延長將藥物逐步釋放出來，具有良好的緩釋特征。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；載藥納米粒；RGD；緩釋；表征

[中圖分類號] TQ461 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）05-09-03

丹參酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）為傳統中藥丹參的有效脂溶性成分，近年來研究表明TSⅡA對肝癌、胃癌等多種消化道腫瘤具有較強的細胞毒作用[1-2]，但因丹參酮ⅡA難溶于水、體內代謝快、生物利用率低等缺點，限制其在臨床上的廣泛應用。課題組前期研究發現丹參酮ⅡA聚乳酸載藥納米粒（TSⅡA-PLA NPs）對肝癌有較好療效[3-5]。本研究采用乳化溶劑蒸發法，制備含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒（TSⅡA-mPEG-

PLGA-PLL-cRGD NPs，TNP），利用納米技術制備的載藥納米粒可以延長藥物在體內作用時間，顯著提高藥物的抗腫瘤作用。本實驗通過對TSⅡA多級靶向納米粒的理化性質進行評價，優選載藥納米粒的制備工藝。

1 材料與儀器

1.1 藥物和試劑

丹參酮ⅡA對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，純度為99.3%）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（由上海市腫瘤研究所段友容課題組提供）；吉非羅齊（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100284-199801）；Poloxamer188（購自德國BASF公司）。

1.2 主要實驗儀器

高分辨透射電鏡（HIATCHIH-7000，日本日立電子公司）；激光粒度散射儀（Nicomp 380/ZLS，美國）；紫外分光光度計（德國Eppendorf公司）；微量電子分析天平（Sartotius CP225D）；低溫高速離心機（Centrifuge 5804R，德國Eppendorf公司）；質譜儀（API 3000，美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 TNP形態及粒徑分布

取實驗制得的TSⅡA多級靶向納米粒，加入純水稀釋至適宜濃度，Nicomp 380/ZLS激光粒度分析儀測定TNP的粒徑。HIATCHIH-7000高分辨透射電鏡考察納米粒的形態。

2.2 測定TNP包封率及載藥量

由于丹參酮為強脂溶性藥物，因此未包封的藥物在水溶液中大部分是以沉淀的形式存在，因此在測定包封率和載藥量前，先低速離心（8000×5min）除去丹參酮沉淀。選用低溫高速離心（離心條件：溫度為-4℃，轉速為17500×g，離心時間為30min）分離納米粒和水溶液，取上清液測定丹參酮含量，沉淀洗滌離心兩次，干燥稱重得納米粒重量。用HPLC來測定丹參酮沉淀和清液中丹參酮藥物的含量。按下列公式計算包封率及載藥量。

包封率=（W藥-W游）/ W藥×100%

載藥量=（W藥-W游）/ W納米粒×100%

W藥：TSⅡA總藥量（mg），W游：游離TSⅡA藥量（mg），W納米粒：載藥納米粒的總重量（mg）。

2.3 TNP體外藥物釋放

實驗采用透析法檢測TNP體外藥物釋放率。主要步驟：精確稱取TSⅡA（1mL）、TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL（1mL）和TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD （1mL）各3份，之后每分分別加入PBS（2mL，pH 7.4），混勻后放入透析袋中，扎緊使其懸浮于具塞錐形瓶中，在錐形瓶中再次加入49mL 0.5% SDS生理鹽水，然后將其置于恒溫水浴振蕩器中持續振蕩（150次/min，37℃）。分別于0.5、1.5、2.5、7.5、12、18、24、48、72、96和120h取樣，每次500μL，隨后立即補入溫度為37℃的0.5% SDS生理鹽水溶液500μL。樣品經HPLC測試，計算丹參酮ⅡA的濃度和累積藥物釋放百分比，以累積釋放藥物的百分率（%）對時間（hours）作圖，繪制釋藥曲線。

3 結果

3.1 納米粒的粒徑分布及形態測試

載藥納米粒的粒徑大小能夠顯著的影響藥物在體內器官的分布。通常認為，粒徑<200nm的納米粒能夠較理想的靶向于腫瘤部位。本實驗制備的TSIIA多級靶向納米粒的形態呈球型，大小均勻，外觀光滑圓整，具有較好的分散性（PDI=0.240），TNP的平均粒徑大小為190nm，Zeta電位為4.3mV。見圖1。

3.2 納米粒包封率和載藥量的測定

結果顯示，采用乳化溶劑蒸發法制備的TNP包封率為（94.12±5.20）%，載藥量（2.05±0.12）%。乳化溶劑蒸發法制得的納米粒包封率和載藥量均高于溶劑-非溶劑法，并且粒徑分布較好，因此選擇乳化溶劑蒸發法制備納米粒。

3.3 納米粒體外藥物釋放的測定

由釋放曲線可發現，游離丹參酮在12h已達到最大釋放，接近100%。之后丹參酮濃度逐漸降低，原因是丹參酮在釋放環境中受熱分解。納米粒表現出明顯的緩釋趨勢：先快速釋放后緩慢釋放。其中mPEG-PLGA納米粒的釋放在7.5h前較快，原因可能是其載藥量較大，待外層的包載的丹參酮釋放完后，釋放過程變得非常緩慢，TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL和TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒在120h累積釋放量分別為72.26%和72.59%。endprint

4 結論

利用納米技術制備的納米粒子具有特定的理化性質，可作為藥物載體改變藥物在體內的分布特征，提高藥物吸收利用度，改善藥物性質和靶向性，延長藥物作用時間。通過控制和修飾載藥納米粒表面性質（形狀、大小、表面電荷、親水性等）[6-8]；或者通過熱敏、pH敏、磁性、超聲波及電磁波響應等各種體內外刺激 [9-12]（被動靶向），以及通過連接靶向分子（如單克隆抗體、特異性的配體等），使載藥納米粒與腫瘤細胞表面能夠特異性的結合[13-15]（主動靶向）；從而發揮更好的靶向作用。本課題采用乳化溶劑蒸發法成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，納米粒大小均一，光滑圓整，且分散性良好，Zeta電位為4.3mV，粒徑在190nm，包封率為（94.12±5.20）%，載藥量為（2.05±0.12）%。實驗結果表明，制成納米制劑后與游離的丹參酮ⅡA單體相比釋放速度明顯減慢，丹參酮ⅡA多級靶向納米粒在120h累積釋放量為72.59%。與丹參酮ⅡA相比，按最優處方工藝制備的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒具有良好的緩釋特征，能夠隨時間的延長將藥物逐步釋放出來。

[參考文獻]

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[15] Díaz MR，Vivas-Mejia PE. Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine： Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

4 結論

利用納米技術制備的納米粒子具有特定的理化性質，可作為藥物載體改變藥物在體內的分布特征，提高藥物吸收利用度，改善藥物性質和靶向性，延長藥物作用時間。通過控制和修飾載藥納米粒表面性質（形狀、大小、表面電荷、親水性等）[6-8]；或者通過熱敏、pH敏、磁性、超聲波及電磁波響應等各種體內外刺激 [9-12]（被動靶向），以及通過連接靶向分子（如單克隆抗體、特異性的配體等），使載藥納米粒與腫瘤細胞表面能夠特異性的結合[13-15]（主動靶向）；從而發揮更好的靶向作用。本課題采用乳化溶劑蒸發法成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，納米粒大小均一，光滑圓整，且分散性良好，Zeta電位為4.3mV，粒徑在190nm，包封率為（94.12±5.20）%，載藥量為（2.05±0.12）%。實驗結果表明，制成納米制劑后與游離的丹參酮ⅡA單體相比釋放速度明顯減慢，丹參酮ⅡA多級靶向納米粒在120h累積釋放量為72.59%。與丹參酮ⅡA相比，按最優處方工藝制備的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒具有良好的緩釋特征，能夠隨時間的延長將藥物逐步釋放出來。

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4 結論

利用納米技術制備的納米粒子具有特定的理化性質，可作為藥物載體改變藥物在體內的分布特征，提高藥物吸收利用度，改善藥物性質和靶向性，延長藥物作用時間。通過控制和修飾載藥納米粒表面性質（形狀、大小、表面電荷、親水性等）[6-8]；或者通過熱敏、pH敏、磁性、超聲波及電磁波響應等各種體內外刺激 [9-12]（被動靶向），以及通過連接靶向分子（如單克隆抗體、特異性的配體等），使載藥納米粒與腫瘤細胞表面能夠特異性的結合[13-15]（主動靶向）；從而發揮更好的靶向作用。本課題采用乳化溶劑蒸發法成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，納米粒大小均一，光滑圓整，且分散性良好，Zeta電位為4.3mV，粒徑在190nm，包封率為（94.12±5.20）%，載藥量為（2.05±0.12）%。實驗結果表明，制成納米制劑后與游離的丹參酮ⅡA單體相比釋放速度明顯減慢，丹參酮ⅡA多級靶向納米粒在120h累積釋放量為72.59%。與丹參酮ⅡA相比，按最優處方工藝制備的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒具有良好的緩釋特征，能夠隨時間的延長將藥物逐步釋放出來。

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[13] Yin P，Wang Y，Qiu Y，et al.Bufalin-loaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles： preparation，cellular uptake，tissue distribution， and anticancer activity[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3961-3969.

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