血府逐瘀湯聯合NGF對多發性腦梗死大鼠海馬CA1區NKB細胞影響的研究

張曄+劉永林+李屹+周酈楠

[摘要] 目的 探討血府逐瘀湯聯合神經生長因子對多發性腦梗死的影響。 方法 選用Wistar大鼠，應用微栓子栓塞阻斷方法，將大鼠造成多發性腦梗死模型，通過大鼠神經行為學改變和海馬組織病理改變來探討血府逐瘀湯聯合神經生長因子對大鼠多發性腦梗死模型的影響。結果 術后7天，治療組與模型組比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=21.3411，P<0.01）。治療組術后7天與術后1天比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=3.4943，P<0.01）。結論 血府逐瘀湯聯合神經生長因子能有效改善多發性腦梗死大鼠神經行為學及海馬組織病理學的改變，是治療多發性腦梗死的有效方法。

[關鍵詞] 血府逐瘀湯；神經生長因子；多發性腦梗死；大鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）05-32-05

我國的腦血管疾病發病率較高，且發病率呈上升的趨勢。其中多發性腦梗死（multiple cerebral infarction，MCI）占有相當大的比重，其臨床表現主要為運動和記憶等功能的障礙，使患者生存和生活質量下降。研究其發病機制和治療方法，對提高人類的生活質量具有重要意義。通過近幾年的研究發現，中國傳統醫學中的活血化瘀法能促進血液循環，使腦部微循環得以改善，還有阻滯神經細胞凋亡和壞死的作用[1]。本實驗通過研究血府逐瘀湯和神經生長因子（nerve growth factor，NGF）聯合應用對MCI的影響，了解其對中長期神經功能康復的作用，并為MCI的臨床治療提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

選用成年Wistar大鼠50只，清潔級，雄性，體重250～300g。

1.2 藥品

血府逐瘀湯（當歸9g，生地9g，桃仁12g，紅花9g、枳殼6g，赤芍6g、柴胡3g，甘草3g，桔梗6g，川芎5g，牛膝9g），由遼寧中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科提供，每劑約200mL。注射用神經活素（Nerve growth factor for injection，NGF），批號：960401，1000BU/支。

1.3 試劑及器材

所采用的DAB及ABC試劑盒、兔抗NKB、羊兔抗血清均購于Sigma公司；LUZEX-F顯微圖像分析儀購于松下公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 適應性飼養5d后，隨機分為3組：正常對照組10只、模型組20只（術后1d取材10只，術后7dd取材10只）、治療組20只（術后1d取材10只，術后7d取材10只）。

1.4.2 多發性腦梗死模型制備 腹腔麻醉（按40mL/公斤體重注射1%戊巴比妥鈉）后，在甲狀軟骨的高度做垂直切口（偏左側），充分暴露左側頸內動脈與頸外動脈并剝離出頸外動脈；用無損傷顯微外科動脈夾在頸總動脈及頸內動脈的遠心端進行夾閉；在頸外動脈上，用顯微外科直剪做一切口，從遠心端向近心端插入靜脈留置針并結扎固定，拔出針芯后松開顯微外科動脈夾，推入肝素鹽水0.2mL（含10肝素單位）及同種屬大鼠全血懸濁液0.5mL（25g/L）；注射后，即刻將頸外動脈剪口處的近心端結扎，松開顯微外科動脈夾，觀察，縫合[2-4]。

1.4.3 術后處理 模型組術后予生理鹽水1mL/（100g·d）進行灌胃。治療組術后予血府逐瘀湯1mL/（100g·d）進行灌胃（按成人體重50kg計算，根據比例Wistar大鼠每100克予1mL，相當于成人一天一劑）；每天一次肌肉注射NGF（NGF1000BU溶于2mL生理鹽水）。

1.4.4 取材切片 用4%多聚甲醛固定液對大鼠進行內固定灌注，內固定結束后，端頭取出腦組織放入同種固定液中進行后固定4h，然后將切成薄塊的腦組織放入20%蔗糖溶液中脫水，在4℃冰箱內保存，直至腦組織薄塊沉底，取出用恒冷切片機作冠狀位連續冰凍切片[5]。

1.4.5 尼氏染色 用PBS漂洗吹干的冰凍切片3次（5min/次），將切片放入37℃的甲苯胺藍溶液（10g/L）中，90min后，取出，用蒸餾水沖洗，再用PBS對切片進行漂洗3次（5min/次），梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，并置于光鏡下觀察。

1.4.6 ABC免疫組織化學染色 用PBS漂洗吹干的冰凍切片3次（5min/次）；室溫下，在正常羊血清（1∶50）中孵育10min；傾去血清，加入兔抗NKB抗體（1∶2000），并在4℃冰箱內過夜；用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加按1∶40稀釋的生物素化抗兔抗體，并在室溫孵育60min；再用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加HRP標記的卵白素1∶40稀釋，在室溫孵育60min；用PBS漂洗3次（5min/次）；用DAB成色5min；用PBS終止反應，并漂洗切片3次（5min/次）；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，并置于光鏡下觀察。

1.5 圖像分析

用顯微圖像分析儀對大鼠海馬CA1區單位面積內存活神經元數及NKB陽性神經元的百分率進行測定。

1.6 統計學分析

所有相關實驗數據均用SPSS17.0軟件進行統計分析，進行多組間比較，數據以（）表示，采用t檢驗方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點各組大鼠海馬CA1區單位面積內神經元數量

術后第1天，模型組存活神經元數量較正常對照組明顯減少（t=28.9584，P<0.01）；治療組存活神經元數量較正常對照組也有減少（t=27.5848，P<0.01）；模型組與治療組之間無顯著差異。術后第7天，治療組與模型組比較存活神經元數量明顯增多（t=6.1230，P<0.01）。治療組術后7d與術后1d比較神經元有明顯增多（t=4.1036，P<0.01）。表1。endprint

2.2 不同時間點各組大鼠海馬CA1區NKB陽性神經元百分率

術后1d，模型組NKB陽性神經元百分率較正常對照組明顯減少（t=26.4986，P<0.01）；治療組NKB陽性神經元百分率較正常對照組有所減少（t=8.8806，P<0.01）。術后7d，治療組與模型組比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=21.3411，P<0.01）。治療組術后7d與術后1d比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=3.4943，P<0.01）。表2

2.3 尼氏染色結果

在尼氏染色切片上，正常對照組大鼠海馬CA1區可見到數量較多、排列緊密、形態完整的神經元，泡漿內尼氏體豐富。模型組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元數量減少，模型組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，有少量神經元存活，治療組（7d取材）與模型組（7d取材）相比，存活神經元數量較多。見圖1。

正常對照組可見分布于神經元胞體及其突起的棕褐色NKB陽性反應物，細胞核不著色，細胞形態完整。模型組（7天取材）可見NKB陽性反應物銳減。治療組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元數量與模型組（1d取材）比較稍多，細胞體呈圓形，突起不明顯；治療組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元胞體呈圓形或者是橢圓形，突起可見。見圖2。

3 討論

中醫認為，多發性腦梗死的發病機制是本虛標實，根據“氣為血之帥”“血為氣之母”，中醫藥確立了益氣補血、活血化瘀、芳香開竅等有效的治療方法?；钛霪煼ㄖ械某Ｓ梅絼┦茄痧鰷怯汕宕t家王清任創制的五大活血化瘀名方之一[6-7]。由當歸、生地、桃仁、紅花、赤芍、枳殼、柴胡、川芎、桔梗、牛膝、甘草十一味藥組成[8]。方藥中的桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍有活血祛瘀的作用；當歸、生地有養血化瘀的作用；柴胡、枳殼有疏肝理氣的作用；牛膝有破瘀通經、引瘀血下行的作用；桔梗有開肺氣的作用，并能引藥上行；甘草可以緩急，方中諸藥共奏活血調氣之功[9]。血府逐瘀湯是由桃紅四物湯合四逆散而成，其不僅可以行血分之瘀滯，又可化解氣分之郁結，活血而不耗血，袪瘀又可生新，使“血府”之瘀逐去而氣機暢通，從而諸證悉除[10]。現代研究發現，血府逐瘀湯還可改善人體微循環、組織器官血氧的含量，增加腦血流量及改善腦代謝，促進肢體功能的恢復，并能降低血液黏稠度，具有抗凝及溶栓等重要作用[11]。

NGF是最早被發現、研究也最為詳細的神經營養因子，其具有營養神經元和促進突起生長的雙重生物學功能，是神經元生長調節劑，它可以調控中樞及其周圍神經元的發育、生長、分化、再生和功能特性的表達[12]。

神經激肽B（neurokinin B，NKB）又稱神經介素K，是一種神經肽，與P物質（substance P，SP）和神經激肽A（neurokinin A，NKA）同屬于速激肽家族，它們在分子結構與作用上有許多相似之處[13]。 NKB陽性神經元在大鼠中樞神經的分布廣泛，如大腦皮層、杏仁核群、嗅球、海馬、隔區、間腦、中腦、后腦、腦干和脊髓后角及脊神經節[14]。Jansen等研究發現，NKB能使處于收縮狀態的大腦動脈松弛，具有較強的舒張腦內微血管的作用[15]。

實驗結果顯示MCI時大鼠海馬CA1區存活神經元數量明顯減少。通過血府逐瘀湯和NGF聯合用藥進行治療后，MCI大鼠神經元的損傷緩解，其存活能力增強，NKB免疫陽性神經元得到恢復，對病理損傷的修復效果顯著。中西醫聯合用藥治療MCI可以增加藥效并降低治療成本，而且，中藥給藥途徑簡單，副作用極低，長期服用不會造成病理性改變。在實際應用中，血府逐瘀湯還可根據中醫辨證進行藥物的加減，更切合患者的實際病情。血府逐瘀湯聯合NGF具有重要的臨床應用價值和經濟效益。

[參考文獻]

[1] 呂中，王寧，王東坡.益氣活血法對缺氧缺血性腦損傷保護作用的實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2011，29（7）：1552-1555.

[2] 周酈楠，張曄，張暉.CGRP對多梗死大鼠海馬CA4區NPY細胞影響的研究[J].中國實用醫藥，2010，5（18）：13-14.

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[4] 張曄，張艷，周酈楠.多發性腦梗死大鼠乳頭體一氧化氮合酶改變[J].中國實用醫藥，2012，7（6）：37-38.

[5] 包新民，舒思云.大鼠腦立體定位圖譜.北京：人民衛生出版社，1991：38-57.

[6] 王玉香，秦榮，李丹，等.血府逐瘀湯的現代應用和實驗研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2007，9（6）：49-51.

[7] 李君梅，燕明宗.血府逐瘀湯對缺血性腦卒中患者頸動脈粥樣硬化的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2009，16（5）：65-66.

[8] 李云龍.血府逐瘀湯信用[J].現代中醫藥，2006，26（1）：45.

[9] 王倬，王寧，王東坡.血府逐瘀湯對缺血缺氧性腦損傷大鼠的保護作用[J].浙江中醫雜志，2009，44（11）：793-795.

[10] 邵淑娟.血府逐瘀湯的臨床應用及研究進展[J].北京中醫藥，2008，27（9）：724-727.

[11] 何洪靜，成詩黔，徐貴麗，等.血府逐瘀湯對大鼠血液流變學的影響[J].中國臨床醫藥研究雜志，2003，102：10529-10521.

[12] 張曄，李屹，劉永林，等.血府逐瘀湯聯合NGF對大鼠多發性腦梗塞模型海馬CA1區神經元影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2013，15（10）：27-29.

[13] 方秀斌，張德林.神經激肽B[J].解剖科學進展，1995，1（1）：49-55.

[14] Warden MK，Young WS.Distribution of cells containing mRNA encoding substance P and neurokinin B in the rat central nervous system[J].J Comp Neurol，1988，272：90.

[15] Jansen I，Alafaci C，Mc-Culloch J，et al.Tachykinins substance P， neurokinin A， neuropeptide K， and neurokinin B in the cerebral circulation I；vasomotor responses in vitro and in situ[J]. J-Cereb-Blood-Flow-Metab，1991，11（4）：567.

（收稿日期：2013-12-03）endprint

2.2 不同時間點各組大鼠海馬CA1區NKB陽性神經元百分率

術后1d，模型組NKB陽性神經元百分率較正常對照組明顯減少（t=26.4986，P<0.01）；治療組NKB陽性神經元百分率較正常對照組有所減少（t=8.8806，P<0.01）。術后7d，治療組與模型組比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=21.3411，P<0.01）。治療組術后7d與術后1d比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=3.4943，P<0.01）。表2

2.3 尼氏染色結果

在尼氏染色切片上，正常對照組大鼠海馬CA1區可見到數量較多、排列緊密、形態完整的神經元，泡漿內尼氏體豐富。模型組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元數量減少，模型組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，有少量神經元存活，治療組（7d取材）與模型組（7d取材）相比，存活神經元數量較多。見圖1。

正常對照組可見分布于神經元胞體及其突起的棕褐色NKB陽性反應物，細胞核不著色，細胞形態完整。模型組（7天取材）可見NKB陽性反應物銳減。治療組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元數量與模型組（1d取材）比較稍多，細胞體呈圓形，突起不明顯；治療組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元胞體呈圓形或者是橢圓形，突起可見。見圖2。

3 討論

中醫認為，多發性腦梗死的發病機制是本虛標實，根據“氣為血之帥”“血為氣之母”，中醫藥確立了益氣補血、活血化瘀、芳香開竅等有效的治療方法?；钛霪煼ㄖ械某Ｓ梅絼┦茄痧鰷?，是由清代醫家王清任創制的五大活血化瘀名方之一[6-7]。由當歸、生地、桃仁、紅花、赤芍、枳殼、柴胡、川芎、桔梗、牛膝、甘草十一味藥組成[8]。方藥中的桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍有活血祛瘀的作用；當歸、生地有養血化瘀的作用；柴胡、枳殼有疏肝理氣的作用；牛膝有破瘀通經、引瘀血下行的作用；桔梗有開肺氣的作用，并能引藥上行；甘草可以緩急，方中諸藥共奏活血調氣之功[9]。血府逐瘀湯是由桃紅四物湯合四逆散而成，其不僅可以行血分之瘀滯，又可化解氣分之郁結，活血而不耗血，袪瘀又可生新，使“血府”之瘀逐去而氣機暢通，從而諸證悉除[10]。現代研究發現，血府逐瘀湯還可改善人體微循環、組織器官血氧的含量，增加腦血流量及改善腦代謝，促進肢體功能的恢復，并能降低血液黏稠度，具有抗凝及溶栓等重要作用[11]。

NGF是最早被發現、研究也最為詳細的神經營養因子，其具有營養神經元和促進突起生長的雙重生物學功能，是神經元生長調節劑，它可以調控中樞及其周圍神經元的發育、生長、分化、再生和功能特性的表達[12]。

神經激肽B（neurokinin B，NKB）又稱神經介素K，是一種神經肽，與P物質（substance P，SP）和神經激肽A（neurokinin A，NKA）同屬于速激肽家族，它們在分子結構與作用上有許多相似之處[13]。 NKB陽性神經元在大鼠中樞神經的分布廣泛，如大腦皮層、杏仁核群、嗅球、海馬、隔區、間腦、中腦、后腦、腦干和脊髓后角及脊神經節[14]。Jansen等研究發現，NKB能使處于收縮狀態的大腦動脈松弛，具有較強的舒張腦內微血管的作用[15]。

實驗結果顯示MCI時大鼠海馬CA1區存活神經元數量明顯減少。通過血府逐瘀湯和NGF聯合用藥進行治療后，MCI大鼠神經元的損傷緩解，其存活能力增強，NKB免疫陽性神經元得到恢復，對病理損傷的修復效果顯著。中西醫聯合用藥治療MCI可以增加藥效并降低治療成本，而且，中藥給藥途徑簡單，副作用極低，長期服用不會造成病理性改變。在實際應用中，血府逐瘀湯還可根據中醫辨證進行藥物的加減，更切合患者的實際病情。血府逐瘀湯聯合NGF具有重要的臨床應用價值和經濟效益。

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[8] 李云龍.血府逐瘀湯信用[J].現代中醫藥，2006，26（1）：45.

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[10] 邵淑娟.血府逐瘀湯的臨床應用及研究進展[J].北京中醫藥，2008，27（9）：724-727.

[11] 何洪靜，成詩黔，徐貴麗，等.血府逐瘀湯對大鼠血液流變學的影響[J].中國臨床醫藥研究雜志，2003，102：10529-10521.

[12] 張曄，李屹，劉永林，等.血府逐瘀湯聯合NGF對大鼠多發性腦梗塞模型海馬CA1區神經元影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2013，15（10）：27-29.

[13] 方秀斌，張德林.神經激肽B[J].解剖科學進展，1995，1（1）：49-55.

[14] Warden MK，Young WS.Distribution of cells containing mRNA encoding substance P and neurokinin B in the rat central nervous system[J].J Comp Neurol，1988，272：90.

[15] Jansen I，Alafaci C，Mc-Culloch J，et al.Tachykinins substance P， neurokinin A， neuropeptide K， and neurokinin B in the cerebral circulation I；vasomotor responses in vitro and in situ[J]. J-Cereb-Blood-Flow-Metab，1991，11（4）：567.

（收稿日期：2013-12-03）endprint

2.2 不同時間點各組大鼠海馬CA1區NKB陽性神經元百分率

術后1d，模型組NKB陽性神經元百分率較正常對照組明顯減少（t=26.4986，P<0.01）；治療組NKB陽性神經元百分率較正常對照組有所減少（t=8.8806，P<0.01）。術后7d，治療組與模型組比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=21.3411，P<0.01）。治療組術后7d與術后1d比較NKB陽性神經元百分率明顯增高（t=3.4943，P<0.01）。表2

2.3 尼氏染色結果

在尼氏染色切片上，正常對照組大鼠海馬CA1區可見到數量較多、排列緊密、形態完整的神經元，泡漿內尼氏體豐富。模型組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元數量減少，模型組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，有少量神經元存活，治療組（7d取材）與模型組（7d取材）相比，存活神經元數量較多。見圖1。

正常對照組可見分布于神經元胞體及其突起的棕褐色NKB陽性反應物，細胞核不著色，細胞形態完整。模型組（7天取材）可見NKB陽性反應物銳減。治療組（1d取材）大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元數量與模型組（1d取材）比較稍多，細胞體呈圓形，突起不明顯；治療組（7d取材）大鼠海馬CA1區切片上，神經元胞體呈圓形或者是橢圓形，突起可見。見圖2。

3 討論

中醫認為，多發性腦梗死的發病機制是本虛標實，根據“氣為血之帥”“血為氣之母”，中醫藥確立了益氣補血、活血化瘀、芳香開竅等有效的治療方法?；钛霪煼ㄖ械某Ｓ梅絼┦茄痧鰷?，是由清代醫家王清任創制的五大活血化瘀名方之一[6-7]。由當歸、生地、桃仁、紅花、赤芍、枳殼、柴胡、川芎、桔梗、牛膝、甘草十一味藥組成[8]。方藥中的桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍有活血祛瘀的作用；當歸、生地有養血化瘀的作用；柴胡、枳殼有疏肝理氣的作用；牛膝有破瘀通經、引瘀血下行的作用；桔梗有開肺氣的作用，并能引藥上行；甘草可以緩急，方中諸藥共奏活血調氣之功[9]。血府逐瘀湯是由桃紅四物湯合四逆散而成，其不僅可以行血分之瘀滯，又可化解氣分之郁結，活血而不耗血，袪瘀又可生新，使“血府”之瘀逐去而氣機暢通，從而諸證悉除[10]。現代研究發現，血府逐瘀湯還可改善人體微循環、組織器官血氧的含量，增加腦血流量及改善腦代謝，促進肢體功能的恢復，并能降低血液黏稠度，具有抗凝及溶栓等重要作用[11]。

NGF是最早被發現、研究也最為詳細的神經營養因子，其具有營養神經元和促進突起生長的雙重生物學功能，是神經元生長調節劑，它可以調控中樞及其周圍神經元的發育、生長、分化、再生和功能特性的表達[12]。

神經激肽B（neurokinin B，NKB）又稱神經介素K，是一種神經肽，與P物質（substance P，SP）和神經激肽A（neurokinin A，NKA）同屬于速激肽家族，它們在分子結構與作用上有許多相似之處[13]。 NKB陽性神經元在大鼠中樞神經的分布廣泛，如大腦皮層、杏仁核群、嗅球、海馬、隔區、間腦、中腦、后腦、腦干和脊髓后角及脊神經節[14]。Jansen等研究發現，NKB能使處于收縮狀態的大腦動脈松弛，具有較強的舒張腦內微血管的作用[15]。

實驗結果顯示MCI時大鼠海馬CA1區存活神經元數量明顯減少。通過血府逐瘀湯和NGF聯合用藥進行治療后，MCI大鼠神經元的損傷緩解，其存活能力增強，NKB免疫陽性神經元得到恢復，對病理損傷的修復效果顯著。中西醫聯合用藥治療MCI可以增加藥效并降低治療成本，而且，中藥給藥途徑簡單，副作用極低，長期服用不會造成病理性改變。在實際應用中，血府逐瘀湯還可根據中醫辨證進行藥物的加減，更切合患者的實際病情。血府逐瘀湯聯合NGF具有重要的臨床應用價值和經濟效益。

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[8] 李云龍.血府逐瘀湯信用[J].現代中醫藥，2006，26（1）：45.

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（收稿日期：2013-12-03）endprint