磷脂酶D的抗逆特性及其活性檢測研究

王秀娟　高山　王國澤

摘要：介紹了磷脂酶D（PLD）的研究現狀及進展，包括其分類、來源和用途，詳述了PLD的抗逆特性和相關作用機理及對PLD活性檢測的最新方法，對PLD在科學研究中的發展前景進行了展望。

關鍵詞：磷脂酶D（PLD）；抗逆特性；活性檢測

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-0998-03

1 概述

1.1 磷脂酶概述

磷脂又稱磷酸甘油脂，廣義上是指磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經鞘磷脂（SM）的復合物，狹義上即為磷脂酰膽堿[1]，是構成生物細胞膜骨架的主要成分，對維持細胞結構的穩定具有重要意義，并且參與細胞代謝和神經細胞的信號傳遞，同時其水解產物能參與多種生理過程以及環境刺激所引起的細胞反應[2]，在細胞的生命活動中起著重要的作用。磷脂的降解酶有多種，而磷脂酶則是催化降解磷脂第一步反應的關鍵酶[3]，此過程是在植物細胞膜上普遍存在的信號轉導途徑。磷脂在磷脂酶作用下水解為脂肪酸、肌醇三磷酸（IP3）、磷脂酸（PA）、二脂酰甘油（DAG）及乙酰膽堿等。根據其水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分為5類，即磷脂酶A1（Phospholipase Al，PLA1）、磷脂酶A2（PhospholipaseA2，PLA2）、磷脂酶B（Phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）[4，5]。

1.2 PLD的分類

PLD為磷脂酰膽堿磷脂水解酶，是磷脂酶的一種，用來催化水解磷脂末端的磷酸二酯鍵形成磷脂酸和親水性的膽堿等[6]，其催化水解作用廣泛存在于萌發種子、衰老器官、逆境脅迫及胞內信號轉導中[7]。PLD屬于多基因家族，具有多分子異質性，通過對擬南芥PLD基因進行序列相似性和生物特性的分析，將其分成6種類型12個成員，即α（3）、β（2）、γ（3）、δ、ε和 ζ（2）[8，9]，同理將大米的PLD基因分成6種類型17個成員，即α（8）、β（2）、δ（3）、ζ（2）、κ和ψ[10]。目前的研究發現，影響PLD活性的因素很多，包括溫度、pH、鹽類、溶劑以及底物的聚合狀態等，不同來源的PLD有著不同的最適影響條件，比如植物中PLD的最適pH 5～6要比微生物中的最適pH 4～8范圍窄[11]。PLD既具有水解特性，又具有轉導特性，且其最基本的功能就是維持細胞膜的穩定性[12]，同時PLD具有較廣的底物特異性，可以作用于多種底物磷脂及其衍生物，且對構成脂的堿基部分沒有絕對的特異性要求[13]，相關研究表明，神經鞘磷脂可能是目前得知的惟一不能被PLD降解的磷脂[14]。

1.3 PLD的用途

PLD作為降解磷脂類物質的主要酶系，在各種細胞反應中扮演著重要的角色，包括細胞轉移、受體的內吞作用、細胞分泌、細胞骨架重組等[15]，同時也在生活生產中得到廣泛應用，比如在醫藥方面。PLD在工業方面可用于油脂精煉、磷脂改性等[16]。總之，PLD已經越來越得到人們的普遍關注。

2 PLD的來源

有活性的PLD最先是在1947～1948年由Hanahan等[17-19]從胡蘿卜根和菠菜葉的提取物中得到的，但是由于其多樣性及不穩定性，其活性一直沒有得到充分利用，直到1994年Wang等[20]從萌發的蓖麻中通過系列試驗得到有活性的PLD基因。迄今為止，從蓖麻、擬南芥、豇豆、甘藍、煙草、水稻、玉米、番茄、黃瓜、甜瓜等多種植物中克隆到的PLD 基因及其功能已經被廣泛研究。雖然PLD普遍存在于動物和植物中，但是由于來源于微生物的PLD種類繁多，多為外分泌表達和單亞基蛋白，容易大量快速制備且成本較低，因而逐漸成為提取磷脂酶的主要來源[5]。常見的產磷脂酶的微生物主要有產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens ）、鏈霉菌（Streptomyces）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[21]，為了改變中國主要采用的微生物菌株由國外購買的現狀[22]，研究人員已逐漸篩選培育出了一些高產磷脂酶的菌株。李軍紅等[23]通過平板初篩和搖瓶復篩的方法獲得的高產菌株，經驗證鑒定其為蠟狀芽孢桿菌（Bacillu scereus），王金梅等[21]則得到的為無色桿菌屬（Achromobacter sp.）細菌，同時對其進行脫膠處理，證明其有良好的應用前景。

3 PLD在抗逆反應中的作用

植物在低溫干旱、機械損傷、病原等逆境脅迫下，可通過信號轉導迅速啟動響應機制來調節自身的生理狀態，以產生適應性或抗逆性[24]。研究發現，許多逆境下的信號轉導過程都與植物體內PLD的激活有關[25]，當一些病原菌侵染植物時，植物中的PLD的調節活動明顯增強。近年來，磷脂酶在干旱、低溫、機械損傷等逆境條件下的反應機理已逐漸被發現。

3.1 低溫逆境

植物與外界環境接觸的首要部位即為細胞膜，細胞膜是由磷脂雙分子層構成的，蛋白質穿插在其中，磷脂作為細胞膜的主要成分，維持著細胞的結構和功能。當植物受到低溫脅迫時，其細胞膜中的磷脂含量會隨著低溫脅迫的嚴重程度而發生變化，以適應外界環境的變化。磷脂酶作為降解磷脂的主要酶，其活性直接影響了細胞膜磷脂的含量，進而間接影響植物對低溫的抵抗作用[26]。Welti等[27]的試驗表明，經過低溫處理后PLD基因缺失型植株膜離子滲漏率與野生型植株明顯不同，而膜離子滲漏率是反映膜穩定性的重要指標，同時發現低溫處理后的兩種植株的膜成分均發生了明顯的變化。曾正兵等[28]的試驗同樣證明在8～16 ℃的凍害脅迫下，PLDα缺失型植株的離子滲漏率不同于野生型，可見PLD基因主要通過影響膜的穩定性來抵抗低溫環境。

3.2 干旱脅迫

當植物處于干旱狀態時，為了維持體內的水分充足，由脫落酸（ABA）誘導氣孔關閉的敏感性將會升高，從而氣孔關閉，蒸騰作用會減弱，進而減少水分的流失。同時經過大量的試驗研究發現，PLD參與ABA介導的信號轉導途徑。因此，在干旱條件下，PLD的活性增強，進而促使ABA誘導氣孔關閉，使植株內的水分不會大量流失，更能適應干旱條件。Sang等[29]的試驗表明，PLD基因抑制型植株葉片的蒸騰失水率顯著高于野生型。孫磊[26]的試驗表明，當PLD的活性增強時，植物的氣孔導度顯著下降，水分喪失明顯減少，抗旱能力有所提高。由此可見，PLD基因主要通過參與水分脅迫條件下的氣孔調節作用來影響植物的抗旱性。

3.3 機械損傷

PA是磷脂酶水解磷脂的產物，同時也是信號轉導的第二信使，參與許多細胞內生化反應。植物中的PA不僅可以激活一些激酶來共同參與信號轉導，也可以作為中間體來參與其他脂質體的合成[30]。當植物受到機械損傷時，PLD活性增強，PA含量顯著增加，誘導細胞的信號反應，同時膜上的鈣離子的含量也調節了PLD的含量，從而影響PA含量。Ryu等[31]報道，Ca2+會引起與膜結合PLD的增加，表明植物在干旱條件下Ca2+參與PLD的調控，趙宇瑛[32]的試驗表明，植物在干旱條件下，細胞膜Ca2+含量減少，黃瓜PLD酶活性增強，進而PA含量顯著增加。由此可見，植物通過膜上Ca2+的濃度來影響PLD和PA的含量，以達到抗旱效果。

3.4 其他

植物在受到其他逆境脅迫時，如病原微生物、植物激素等也會發生一系列的抗逆反應，如當植物遭受病原微生物侵害時，PLD會集中于微生物與質膜的接觸部位，發生活性和定位的改變，以抵御病原菌的感染[33]。當植物遇到植物激素如乙烯時，部分植物激素激發PLD的生成，繼而使PA的含量增加，共同作用來延緩植物的衰老過程。

4 PLD活性的檢測

由于PLD在植物的信號轉導、抗逆反應及植物油脫膠等方面有著重要作用，因此對PLD活性的研究逐漸成為人們關注的焦點，PLD活性的測定方法一般是以檢測其催化磷脂水解所生成的產物的量為依據的，如分光光度法、化學發光法、滴定法、直接標記法等，當前最常用的方法主要有底物放射標記法、酶聯比色法和高效液相色譜法等。

4.1 底物放射標記法

底物放射標記法是通過直接對PLD反應的底物進行標記而測定其活性[34]。它是PLD活性檢測中最敏感的一種方法，且其結果穩定，準確性高，誤差小，重復性好，但其試驗過程具有放射性，易對操作人員身體造成傷害，對試驗設備要求較高，所以較難普及。

4.2 酶聯比色法

酶聯比色法是以PLD催化水解磷脂酰膽堿末端的磷酸二酯鍵生成膽堿，進而生成的H2O2為基準進行測定PLD活性的一種方法[35]。該方法具有高效便捷、靈敏度高、危害性小和結果穩定的優點，但是耗費藥品量大，操作繁瑣，所以一般適用于在測定材料的PLD含量很低，且難于提取的情況。

4.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法是以熒光標記的磷脂酰膽堿作為底物，利用轉磷脂酰反應原理來測定PLD 活性的一種方法[36]。高效液相色譜法是一種簡便、快速、準確、靈敏的方法，已被廣泛地應用于PLD活性的檢測，具有良好的科研和臨床應用價值，是一種很好的測定PLD的方法。

4.4 試劑盒法

用上海杰美基因醫藥科技有限公司出售的PLD 總活性比色定量檢測試劑盒來測定PLD的活性，操作簡便，結果準確，可以被普遍應用。目前用于測定PLD活性的方法已越來越多，但在人們的日常科研中，由于測定的材料、目的及實驗室條件限制等因素，應根據具體情況來選擇適宜的測定方法。

5 前景與展望

PLD在人們的生活生產領域有著廣泛的應用，雖然目前人們已經意識到PLD具有良好的發展前景，但是其來源仍然只局限于在植物和動物中提取，對微生物來源的研究甚少，同時對其活性的檢測方法雖然很多，但是其或多或少存在不足，因此，要致力于培育優良的微生物菌種，以能大量提取PLD，并且要研究出更適合檢測PLD活性的簡便通用的方法，為PLD 的發展提供更好的依據。

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