地鱉蟲纖溶酶的三維結構模擬與序列分析

余磊　韓雅莉

摘要：為了研究地鱉蟲（Eupolyphage sinensis Walker）纖溶酶的溶栓機理，根據地鱉蟲纖溶酶成熟肽編碼序列，利用生物信息學方法，對地鱉蟲纖溶酶進行了結構分析，用Biosun軟件的同源模建技術，模擬了其三維結構。利用GOLDKEY軟件，對地鱉蟲纖溶酶的氨基酸序列進行了分析，討論了其等電點、親水性、柔性與催化活性之間的關系。結果表明，地鱉蟲纖溶酶的活性中心是組氨酸、絲氨酸和天冬氨酸3個氨基酸殘基，位于球蛋白中心凹穴處，底物結合部位是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，該類酶水解纖維蛋白的機理是催化精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵水解。

關鍵詞：地鱉蟲（Eupolyphage sinensis Walker）；纖溶酶；三維結構；序列

中圖分類號：Q55；R857.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1185-04

地鱉蟲 （Eupolyphage sinensis Walker）又名土元、土鱉，屬節肢動物門昆蟲綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲，為《中華人民共和國藥典》記載的正品藥材，是傳統的活血化瘀類動物藥，其藥用功效主要為逐瘀、破積、通絡等。廣東工業大學纖溶先導藥物課題組在進行地鱉蟲纖溶活性成分研究時，從該蟲體內分離純化得到了地鱉蟲纖溶酶[1，2]，對此類纖溶酶基因 DNA序列進行了分析研究，克隆得到其中一種地鱉蟲纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號：DQ396618），并將其用赤畢酵母表達[3]。為了深入探討地鱉蟲纖溶酶的纖溶作用機制，確定其活性中心的位置，本研究利用生物信息學方法，對地鱉蟲纖溶酶序列進行多方位分析，并建立了地鱉蟲纖溶酶可靠的三維結構模型，揭示了其纖溶機理，為今后進一步研究提供參考。

1 理論與方法

要想了解蛋白質的立體結構，只有將蛋白質溶液結晶，利用X射線衍射分析蛋白質的單晶，通過衍射數據，得到蛋白質的立體結構。但是蛋白質結晶條件苛刻，而且不是所有的蛋白質都能變成單晶。但是利用現代計算機技術，可以對已知氨基酸序列的蛋白質三維結構做出預測，同時還能對蛋白質序列中的每個氨基酸逐個分析，即比較蛋白質模建，又稱為同源模建。該方法是目前應用最廣的蛋白質三維結構預測方法[4-6]。本研究將地鱉蟲纖溶酶的蛋白質序列提交到NCBI的自動比較蛋白質模建服務器Blast上，通過程序自動確定了地鱉蟲纖溶酶序列活性中心與底物結合的部位（圖1），Biosun軟件模擬生成了地鱉蟲纖溶酶的三維結構。利用GOLDKEY軟件，對地鱉蟲纖溶酶全序列的等電點、親水性、柔性進行分析，利用無模型比對時活性中心氨基酸殘基的性質，進一步闡明地鱉蟲纖溶酶的纖溶機理。

2 結果與分析

2.1 三維結構模擬與評估

將地鱉蟲纖溶酶蛋白質序列導入Biosun軟件，軟件自動選取蛋白質Tryp_SPc[cd00190]為模板，模擬目的蛋白質的三維結構，結果見圖2。其中a、b、c 3個球狀模型，分別對應S178、H41、D85 3個氨基酸殘基側鏈（羥基、咪唑基、羧基），與胰蛋白酶催化三聯體結構一致[7，8]。d、e、f 3個肽鍵鏈狀模型，分別對應于地鱉蟲纖溶酶的底物結合部位D172、S193、G195。由三維結構可以看出，底物結合部位和酶催化活性中心都沒有α螺旋和β折疊（α螺旋為柱狀區，β折疊為板狀區），該區域容易發生形變，在催化過程中跟底物結合時產生誘導契合，符合酶催化理論。酶活中心處于這個蛋白質中心的凹穴處，與通常對纖溶酶活性中心的認識一致[9，10]。筆者在前期試驗中發現，該酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測其為絲氨酸蛋白酶[1，2]，此推測與生物信息學方法找到的活性中心S178結論一致。

對模板蛋白質和目的蛋白質進行同源性比對（圖3），Blast軟件給出89.9的評分，說明模板蛋白和地鱉蟲纖溶酶的同源性比較高，二者序列覆蓋率達到99%。隨機匹配的可能性為2×10-19，這么小的隨機匹配可能性，說明2個蛋白質相同的序列部分，不是偶然出現的，是具有同源性的。二者最大序列的相似度達到43%。以此模板蛋白質進行同源模建，結果可信。

2.2 GOLDKEY軟件的序列分析

在地鱉蟲纖溶酶三維結構分析中，采用的是同源模建的方法。在預測的時候，其他蛋白質與目標預測物的差異會導致一定程度的偏差。采用GOLDKEY軟件對序列的每個殘基逐個計算其特性，雖然無法得到三維結構，但是其數據可靠性更好，更能反映目標蛋白質的特性。圖4為利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列的等電點進行模擬。由圖4可知，該蛋白質的等電點為9.67。在通常生理環境下，該蛋白質帶正電。纖維蛋白通常帶負電荷，所以地鱉蟲纖溶酶很容易靠近纖維蛋白質，與之結合，表明該酶對血栓有一定的靶向作用。

利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列進行親水性模擬（圖5）。由圖5可知，地鱉蟲纖溶酶序列中每個氨基酸的親水值越大，親水性越強。其中H41為0.5，D85、S178、D172、S193、G195均為0。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結合部位，其親水值均比較低。在序列中，這6個殘基的親水值都處于局部最低點（相鄰殘基的親水值均較高）。對于水溶性球形蛋白質，親水值較低的氨基酸趨向于蛋白質的內部，親水值較高的氨基酸趨向于蛋白質的外部，從一級結構上的親水性推測，H41、D85、S178、D172、S193、G195這6個氨基酸都位于蛋白質的內部，與三級結構相符。

利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列進行柔性模擬（圖6）。由圖6可知，地鱉蟲纖溶酶序列中每個氨基酸的柔性值，其中H41=0.91，D85=0.93，S178=1.12， D172=1.03，S193=0.93，G195=0.93。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結合部位，其柔性值均比較大，符合酶促反應動力學誘導契合理論。在結合底物時，活性中心的結構和底物的結構都發生了一定的形變（柔性才能形變），使其在空間結構上互補，從而能很好的契合。但是從全序列柔性值來看，催化中心和底物結合部位的柔性并非最大，而且催化中心和底物結合部位的柔性還處于局部最低點，都在峰谷處。這正好驗證了酶結構的相對穩定性。酶具有高效性和專一性的催化特點，決定這些特點的關鍵不僅僅是因為酶活性中心的關鍵基團，也與酶的特殊空間結構有著不可分割的關系。所以酶關鍵部位的空間結構也不能有太大的柔性，更不能隨意變形。

2.3 纖維蛋白水解部位結構分析

體內纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之斷裂的過程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結合處的輸水區，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結合部位D172的羧基結合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側鏈長度和結構幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結構上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協同效應下[12]，能協助肽鍵斷裂時的電子轉移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結構進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結合部位為D172、S193、G195。其三維結構可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

參考文獻：

[1] 韓雅莉，李偉張. 地鱉纖溶蛋白純化及性質研究[J].生物工程學報，2006，22（4）：639-643.

[2] 李穗晶，韓雅莉，張冬梅，等. 地鱉纖溶活性蛋白（EFP）的分離純化、紅外光譜分析及抑制雞胚尿囊膜（CAM）血管生成研究[J].高等學校化學學報，2009，30（10）：1998-2002.

[3] 李興暖，韓雅莉. 地鱉蟲纖溶活性蛋白cDNA序列克隆與畢赤酵母表達[J].生物技術通報，2009（11）：140-144.

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[12] SWAIN C G，BROWN J F.Concerted displacement reactions. VII. the mechanism of acid——base catalysis in non-aqueous solvents[J]. Journal of the American Chemical Society，1952， 74（10）：2534-2537.

2.3 纖維蛋白水解部位結構分析

體內纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之斷裂的過程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結合處的輸水區，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結合部位D172的羧基結合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側鏈長度和結構幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結構上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協同效應下[12]，能協助肽鍵斷裂時的電子轉移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結構進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結合部位為D172、S193、G195。其三維結構可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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2.3 纖維蛋白水解部位結構分析

體內纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之斷裂的過程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結合處的輸水區，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結合部位D172的羧基結合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側鏈長度和結構幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結構上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協同效應下[12]，能協助肽鍵斷裂時的電子轉移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結構進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結合部位為D172、S193、G195。其三維結構可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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