shRNA沉默CtBP2基因對前列腺癌細胞的增殖作用

劉 妍徐 勇 高 超張志宏

shRNA沉默CtBP2基因對前列腺癌細胞的增殖作用

劉 妍1徐 勇2△高 超1張志宏2

目的 探討RNA干擾技術沉默羧基末端結合蛋白（CtBP）2基因表達對前列腺癌PC3細胞增殖能力的影響。方法實驗分為空白對照組、轉染空質粒組、轉染shRNA組。設計并合成針對CtBP2的3條特異性短發卡RNA（shRNA）模板，構建CtBP2-shRNA重組質粒，轉染PC3細胞。通過RT-PCR檢測CtBP2 mRNA的表達水平；采用Western blot法檢測CtBP2蛋白表達的水平，運用MTT法檢測沉默CtBP2對PC3細胞體外增殖的抑制作用。結果將CtBP2-shRNA轉染前列腺癌PC3細胞后，CtBP2 mRNA以及蛋白的表達水平均明顯下降。沉默CtBP2表達后，MTT結果顯示轉染shRNA組的PC3細胞較空白對照組、轉染空質粒組細胞增殖能力明顯減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論CtBP2-shRNA可抑制CtBP2在前列腺癌細胞中的表達并抑制腫瘤細胞生長，提示CtBP2可作為前列腺癌基因治療的一個新靶點。

前列腺腫瘤；細胞系,腫瘤；RNA干擾；細胞增殖；羧基末端結合蛋白

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是危害男性健康最常見的惡性腫瘤[1]。我國PCa的發病率近年也呈逐年增長的趨勢[2]。RNA干擾（RNA inference，RNAi）是一種在轉錄水平及轉錄后阻斷基因表達的新技術，由雙鏈RNA誘發的導致同源mRNA高效特異性降解。RNA干擾技術的建立和發展，為PCa尤其是晚期PCa提供了全新的治療策略。羧基末端結合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）基因在進化上保守，能與多種轉錄因子相互作用，參與多個腫瘤相關基因的轉錄調控,發揮轉錄輔助抑制因子的功能,與腫瘤的發生發展密切相關[3-4]。最近，全基因組關聯研究（Genome Wide Association Studies, GWAS）已經發現導致PCa危險因素的CtBP2敏感性位點，證實CtBP2在PCa組織中的表達明顯高于正常前列腺組織[5]。本研究通過在PC3細胞中轉染短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)，以阻斷細胞中CtBP2的表達，從而觀察CtBP2基因沉默后對PC3細胞增殖能力的影響，以期為PCa患者尋找新的靶向治療基因。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人PCa PC3細胞系由本研究室凍存。

1.2 主要試劑 從http:∕www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank中獲得人CtBP2和β-actin基因序列，應用Primer Primier 5.0軟件設計引物，由Invitrogen公司合成，各引物序列，見表1。shRNA質粒購自GeneCopoeia公司；胎牛血清購自Hyclone公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司；RNA提取試劑Trizol和轉染試劑Lipofectamine2000和反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；PCR試劑盒購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒購自康為世紀；ECL發光試劑盒購自Millpore公司；血清白蛋白（BSA）購自Newprobe公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自博士德公司。一抗羊抗人CtBP2多克隆抗體和二抗驢抗羊IgG-HRP均購自Santa Cruz公司；二甲基亞砜（DMSO）、丙烯酰胺及N,N-二甲基雙丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯（DEPC）均購自Sigma公司。

Tab.1 Primers for PCR表1 PCR反應引物

1.3 重組質粒pUC-U6-shRNA-CtBP2 從GenBank中Ct-BP2 mRNA(NM001290215)上尋找符合特征的靶序列，合成分別針對其靶編碼區（838-857位點、1303-1322位點、341-360位點）堿基序列的兩條DNA寡核苷酸鏈（分別為CtBP2-shRNA-1,-2,-3）。合成的2條互補寡核苷酸鏈在退火緩沖液作用下退火，形成具有9個核苷酸環的shRNA，經BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內切酶線性化,在T4 DNA連接酶的作用下，通過其莖上的19 nt反義寡核苷酸與CtBP2 mRNA上的靶序列結合，誘導CtBP2 mRNA的酶切降解，形成pUC-U6-shRNA-CtBP2重組質粒,攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因及氨芐青霉素、嘌呤霉素抗性基因、含U6啟動子及BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點。CtBP2-shRNA-1序列為5′-CTGCCACATCCTCAACCTG-3′，CtBP2-shRNA-2序列為5′-CCTCGACGTGCATGAGTCA-3′，CtBP2-shRNA-3序列為5′-ACGCAGACTCCTGCAAGTT-3′。

1.4 篩選沉默最佳shRNA序列 根據GeneCopoeia公司提供的shRNA使用說明書，通過濃度梯度實驗確定最適篩選濃度，篩選出干擾效果最佳的質粒CtBP2-shRNA-1。

1.5 細胞培養及轉染 PC3細胞接種于含10％胎牛血清的RPMI1640培養液培養，37℃、5％CO2孵箱中培養。實驗分空白對照組、轉染空質粒組、轉染 shRNA組，按照 Lipofectamine 2000轉染試劑說明進行轉染，分別在轉染后12、24 和48 h檢測各組細胞的轉染效率，分析不同組間細胞生長情況。

1.6 RT-PCR法檢測各組細胞mRNA表達 空白對照組、轉染空質粒組、轉染shRNA組轉染到PC3細胞48 h后，提取總RNA，測定總RNA濃度按反轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，反應條件：94℃預變性3 min；94℃30 s；56℃30 s，循環24次；72℃60 s；72℃總延伸10 min。以上PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀上觀察結果并成像，依據標準曲線計算目的基因和內參基因mRNA量，每個樣品目的基因與內參基因的比值，即為校正后的相對含量，實驗重復3次。

1.7 Western blot法檢測各組細胞蛋白表達 空白對照組、轉染空質粒組、轉染shRNA組轉染到PC3細胞72 h后，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，10％ SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉后，加入1∶500稀釋的一抗在4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶5 000稀釋的二抗孵育，洗膜，應用免疫印跡化學發光試劑（ECL）顯示蛋白質條帶，暗室曝光，用Quantity One軟件進行條帶灰度分析。

1.8 MTT法檢測各組細胞增殖能力的變化 在EP管內將各組細胞懸液充分打勻，按每孔3 000個細胞接種于96孔培養板，每組設6個復孔，24 h后換液。于轉染后24、48、72 h，每孔加入MTT試劑10 μL，于37℃5％CO2條件下繼續孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL∕孔，室溫下置水平搖床搖10 min以充分溶解MTT結晶。在酶聯免疫測定儀上選擇波長570 nm，空白孔調零，測定各孔OD值，計算細胞生長抑制率。

1.9 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，實驗數據用±s表示，組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組干擾質粒干擾CtBP2后其mRNA的表達 以轉染空質粒組為標準，β-actin為內參，轉染shRNA組其mRNA表達水平，見圖1，證實CtBP2-shRNA-1干擾質粒在mRNA水平上抑制CtBP2基因表達的效果最為顯著。

Fig.1 Silence effect of CtBP2-shRNA圖1 干擾質粒對CtBP2 mRNA的沉默效果

2.2 CtBP2-shRNA-1干擾CtBP2后其mRNA和蛋白的表達 空白對照組與轉染空質粒組PC3細胞中CtBP2 mRNA及蛋白表達差異無統計學意義，但均高于轉染shRNA組（P＜0.05），見表2，圖2。

2.3 轉染 shRNA組對 PC3細胞生長的抑制作用 轉染shRNA組在24、48、72 h后，PC3細胞生長明顯慢于空白對照組以及轉染空質粒組（P＜0.05），空白對照組與轉染空質粒組PC3細胞的增殖率差異無統計學意義，見表3。

Fig.2 Western blot detect PC3 cells after transfection CtBP2 protein expression圖2 Western blot檢測轉染后PC3細胞中CtBP2蛋白表達

Tab.2 Transcription and Expression levels of CtBP2 mRNA and protein in PC3 cells表2 PC3細胞中CtBP2 mRNA及蛋白的表達情況（n=3,±s）

Tab.2 Transcription and Expression levels of CtBP2 mRNA and protein in PC3 cells表2 PC3細胞中CtBP2 mRNA及蛋白的表達情況（n=3,±s）

＊P＜0.05；a與（3）組比較，P＜0.05

組別空白對照組（1）轉染空質粒組（2）轉染shRNA組（3）F mRNA 0.790±0.110a0.594±0.256a0.254±0.017 125.614＊蛋白0.826±0.042a0.793±0.038a0.204±0.011 653.764＊

Tab.3 Comparison of PC3 cell proliferation in different groups表3 各處理組不同時間PC3細胞增殖率比較（n=3，OD值,±s）

Tab.3 Comparison of PC3 cell proliferation in different groups表3 各處理組不同時間PC3細胞增殖率比較（n=3，OD值,±s）

＊P＜0.05；a與（3）組比較，P＜0.05

組別空白對照組（1）轉染空質粒組（2）轉染shRNA組（3）F 24 h 0.143±0.005a0.144±0.005a0.133±0.003 11.447＊48 h 0.254±0.020a0.274±0.017a0.152±0.017 77.578＊72 h 0.472±0.029a0.483±0.005a0.242±0.007 372.698＊

3 討論

PCa的發生與發展受多個基因的調控，分子生物學的發展在腫瘤的早期診斷、監控和預后判斷上為臨床提供了重要依據[6]。近年來，RNA干擾技術在多種腫瘤的基因治療中被證實具有強大的基因沉默作用[7]。因此，本實驗應用RNA干擾技術研究特異性shRNA對PCa細胞增殖能力的影響。

CtBP基因作為輔阻遏物與多種轉錄因子聯系而參與到很多生物過程中，如細胞分化、凋亡、發育和腫瘤發生[8]。Kovi等[9]報道，CtBP2能通過轉錄因子基本kruppel樣因子與Bik啟動子結合而替代閱讀框,通過與CtBP2結合從而清除CtBP2∕BKIF對 Bik啟動子的抑制，促進由非P53依賴的凋亡途徑使細胞凋亡。Tsilidis等[5]研究表明，CtBP2中單核苷酸多態性（SNP）位點與PCa的發病風險密切相關，CtBP2的表達與磷脂酰肌醇激酶3通路的活性相關，它主要是由上游的胰島素樣生長因子調控的。然而，Waters等[10]對多種族人群的研究發現，CtBP2中的SNP位點與PCa的發病風險無明顯相關性。因此，本研究進一步觀察CtBP2在PCa中的作用機制，采用RNA干擾技術沉默CtBP2基因的表達，以期為前列腺癌基因治療尋找新靶點。

本研究通過3組干擾質粒干擾CtBP2基因，將CtBP2-shRNA轉染進PCa PC3細胞系中，可有效抑制CtBP2在細胞內的表達，證實CtBP2-shRNA-1干擾質粒在mRNA水平上抑制CtBP2基因的表達效果最為顯著，從而對CtBP2基因實施基因沉默。通過PCR和Western Blot的結果表明，轉染CtBP2-shRNA組的PC3細胞CtBP2 mRNA和蛋白表達水平明顯受到抑制；轉染CtBP2-shRNA組使CtBP2表達降低后，PC3細胞的生長較空白對照組及轉染空質粒組受到了明顯的抑制；空白對照組及轉染空質粒組差異無統計學意義，提示空白對照組和轉染空質粒組的PC3細胞毒性輕微。MTT實驗證明Ct-BP2表達降低能夠顯著抑制PCa細胞增殖，證明Ct-BP2在PCa細胞沉默后對PCa細胞的影響對PCa腫瘤的形成和發展具有重要作用。由此可以說明CtBP2的表達與PC3細胞的生長具有相關性。因此推測CtBP2很可能成為一個新的PCa預測指標。

本研究設計合成的靶向CtBP2基因的shRNA成功轉染PC3細胞,沉默CtBP2基因的表達，并且抑制PC3細胞的生長,說明CtBP2與PC3細胞的生長具有相關性。抑制CtBP2的表達可能成為基因治療PCa的方法之一，從而為臨床治療提供了實驗基礎，RNA干擾方法可能成為腫瘤基因治療的一條新途徑。

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（2014-02-27收稿 2014-06-16修回）

（本文編輯 李國琪）

Study of Effect of CtBP2 Knockout through shRNA on Proliferation of Prostate Cancer Cells

LIU Yan1,XU Yong2△,GAO Chao1,ZHANG Zhihong2
1Prostate Disease Laboratory,Tianjin Institute of Urology,Tianjin 300211,China；2Urology Department,the Second Hospital of Tianjin Medical Univercity
△

E-mail:xuyong8816@sina.com

ObjectiveTo study the effects of shRNA-CtBP2 on the growth of prostate cancer PC3 cells.MethodsThere were three experimental groups in this study，which include blank control group,empty plasmid transfected group and transfected shRNA group.CtBP2 mRNA sequence is targeted by 3 pairs of designed interfering shRNA to built shRNA-Ct-BP2 recombinant plasmid then it is transfected into PC3 cells.Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot assays were used to detect the transcription and expression levels of CtBP2 mRNA and protein,respectively.PC3l proliferation was measured by MTT assay.ResultsBuilting shRNA-CtBP2 recombinant plasmid and transfecting PC3 cells were successful.Transcription and expression levels of CtBP2 mRNA and protein were significantly decreased in shRNA-CtBP2 transfected PC3 cells.After CtBP2 silencing,cell proliferation was blocked in the shRNA-CtBP2 cells compared to that of blank control group(P＜0.01).ConclusionshRNA-CtBP2 could significantly inhibit CtBP2 expression,suppress the growth of PC3 cells,which suggests that CtBP2 may be a new target for PCa gene therapy.

prostatic neoplasms;cell line,tumor;RNA interference;cell proliferation;CtBP

R737.25

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.005

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（12JCYBJC31400）;天津市科委抗癌重大專項攻關計劃項目（12ZCDZSY17200）

1天津市泌尿外科研究所前列腺疾病研究室（郵編300211）;2天津醫科大學第二醫院泌尿外科

△通訊作者 E-mail:xuyong8816@sina.com