血必凈對膿毒癥大鼠巨噬細胞移動抑制因子和急性腎損傷的干預效果

王永明 喬佑杰 李家瑞 尚躍豐 尤丕聰

血必凈對膿毒癥大鼠巨噬細胞移動抑制因子和急性腎損傷的干預效果

王永明1喬佑杰2△李家瑞1尚躍豐1尤丕聰1

目的 觀察膿毒癥急性腎損傷大鼠腎組織及血清巨噬細胞移動抑制因子（MIF）的表達規律，并探討血必凈注射液對膿毒癥大鼠MIF表達的影響及急性腎損傷的防治作用。方法采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備膿毒癥模型。健康SD大鼠80只按隨機數字表法分為假手術組（n=16）、模型組(n=32)和血必凈組（n=32），分別于術后2、8、24和48 h 4個時間點處死取材。采用實時定量PCR檢測腎組織MIF mRNA表達,酶聯免疫法檢測血MIF表達；同時用生化分析儀測定血清肌酐（Cr）水平。結果與假手術組比較，模型組大鼠腎組織MIF mRNA表達于CLP后8、24、48 h顯著升高（P＜0.05），血清MIF及Cr水平于CLP后24、48 h顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，血必凈組大鼠腎組織MIF mRNA于2、8、24、48 h明顯下降（P＜0.05），血清MIF及Cr水平于24、48 h亦顯著下降（P＜0.05）。結論MIF可能作為晚期炎癥因子參與膿毒癥大鼠急性腎損傷的病生理過程。血必凈注射液可抑制MIF的表達，對膿毒癥大鼠腎損傷具有保護作用。

膿毒癥；巨噬細胞移動抑制因子；急性腎損傷；血必凈注射液；肌酐

膿毒癥是目前急危重癥領域最受關注的臨床難題之一，是引起重癥患者發生急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）的最主要原因。50％以上的AKI是由膿毒癥所導致的，同時AKI的發生又可進一步加重膿毒癥病情[1]。膿毒癥導致的AKI如能早期發現并及時干預，可阻止腎臟功能的不可逆損傷，最終可能會降低患者的病死率[2]。研究發現巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）是一種重要的炎癥因子，可通過促進多種炎癥因子的產生和負向調節糖皮質激素的抗炎作用參與膿毒癥的發病[3]。本研究通過建立大鼠膿毒癥模型，應用中藥血必凈注射液（簡稱血必凈）進行干預，觀察腎組織及血清中MIF表達的變化規律及其與腎功能指標改變的關系，探討血必凈對膿毒癥大鼠血清及腎臟MIF表達的影響及對腎損傷的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠80只，8～10周齡，體質量200～220 g，購自北京大學醫學部實驗動物中心；大鼠MIF酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、TRIZOL購自天津灝洋有限公司，實時定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 SD大鼠適應性飼養1周后隨機編號1～80，以編號為依據采用抽簽法隨機抽取16只作假手術組、32只作模型組，32只作血必凈組。每組按照處死動物取標本時間分為2、8、24、48 h 4個亞組，假手術組（每組4只），模型組及血必凈組（每組8只），大鼠術后常規飼養。假手術組及模型組于術后開始給予生理鹽水4 mL∕kg，血必凈組于術后開始給予血必凈4 mL∕kg，均為每12 h給藥1次直至動物死亡或實驗結束。

1.2.2 動物模型制備 參照Chaudry等[4]報道的方法建立盲腸結扎穿孔術誘導的大鼠膿毒癥模型。膿毒癥組及血必凈組以4％水合氯醛，按300 mg∕kg腹腔注射麻醉后固定，75％乙醇腹部消毒。沿腹正中線做2.0 cm切口，找到盲腸，用7號絲線在盲腸根部結扎盲腸。用16號針穿刺盲腸2次，并留置一條寬0.5 cm、長2 cm橡皮引流條貫通盲腸以防針孔閉合，之后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術畢立即予動物腹腔注射生理鹽水20 mL∕kg抗休克。假手術組如同膿毒癥造模術麻醉、消毒和開腹，找到盲腸后將其拉出腹外放置1 min之后還納關腹。

1.2.3 標本的采集與處理 各實驗組按照2、8、24、48 h分別處死大鼠，心臟取血，所取血樣靜置20 min后離心取血清。大鼠處死后開腹留取右側腎組織100 mg用于制備腎組織勻漿。

1.2.4 指標檢測 血清肌酐（Cr）使用 Beckman Coulter Dxc800型自動生化分析儀測定，血清MIF采用ELISA測定。應用實時定量PCR反應（q-PCR）檢測腎組織MIF mRNA表達。引物由上海生物工程有限公司合成，MIF引物上游5′-CGCCCAGAACCGCAACTACA-3′，下游5′-GACCACGTGCACTGCGATGT-3′，擴增長度161 bp；β-actin引物上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA-3′，下游5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′，擴增長度169 bp。首先進行腎組織總RNA的制備，然后制備cDNA模板，確定目的基因退火溫度，進行實時定量PCR反應，反應條件：95℃預變性10 min；94℃變性20 s，59℃退火20 s，40個循環；57～96℃繪制熔解曲線。按q-PCR說明書將各個標本的實時PCR結果以經β-actin校正后，應用2-ΔΔct計算后的比率值表示基因表達的相對變化。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，連續型數據服從正態分布者采用均數±標準差表示，3組間總體變化趨勢比較采用析因設計方差分析，組內不同時間點比較、同一時間點不同組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清Cr變化 同組動物血清Cr水平在4個時間點的變化趨勢不全相同（F=49.022，P＜0.01），同一時間點3組動物間不全相同（F=50.968，P＜0.01），時間與處理因素有交互作用（F=18.594，P＜0.001），即3組動物在4個時間點的變化趨勢不全相同。模型組24、48 h均高于血必凈組，模型組和血必凈組24、48 h均高于假手術組（均P＜0.05）；3組間2、8 h血清Cr水平差異均無統計學意義，見表1。

Tab.1 Changes of serum creatinine levels in each group表1 各組大鼠血清Cr水平的變化 （μmol∕L，±s）

Tab.1 Changes of serum creatinine levels in each group表1 各組大鼠血清Cr水平的變化 （μmol∕L，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；組間比較：A與假手術組比較，B與模型組比較，P＜0.05；組內比較：a與2 h比較，b與8 h比較，c與24 h比較，P＜0.05；假手術組各時間點n=4,模型組、血必凈組各時間點n=8,表2、3同

組別假手術組模型組血必凈組F 2 h 31.00±0.93 32.50±0.87 30.12±1.81 0.828 8 h 29.50±0.64 34.12±0.83 34.25±1.62 3.126＊24 h 31.75±1.11 44.50±1.73Aab39.50±2.10ABab8.648＊＊48 h 32.75±0.85 69.50±1.95Aabc44.87±3.10ABabc50.939＊＊F 2.338 141.746＊＊8.506＊-

2.2 血清MIF變化 同組動物血清MIF水平在4個時間點的變化趨勢不全相同（F=28.205，P＜0.001），同一時間點3組間不全相同（F=7.395，P＜0.001），時間與處理因素有交互作用（F=5.645，P＜0.001），即3組動物血清MIF在4個時間點的變化趨勢不全相同。模型組24、48 h均高于假手術組和血必凈組（P＜0.01）；3組間2、8 h血清MIF水平差異無統計學意義，血必凈組和假手術組血清MIF水平在24、48 h差異無統計學意義，見表2。

Tab.2 Changes of serum MIF levels in each group表2 各組大鼠血清MIF水平的變化 （μmol∕L，±s）

Tab.2 Changes of serum MIF levels in each group表2 各組大鼠血清MIF水平的變化 （μmol∕L，±s）

組別假手術組模型組血必凈組F 2 h 12.24±0.91 12.89±1.25 13.19±1.88 0.538 8 h 12.15±1.71 14.94±1.87 13.16±2.80 2.342 24 h 11.75±0.85 18.84±4.02Aab13.92±2.72B8.412＊＊48 h 12.84±1.45 21.90±2.97Aabc14.00±2.23B27.584＊＊F 0.486 17.226＊＊0.276 -

2.3 腎組織MIF mRNA變化 同組動物腎臟MIFmRNA表達水平在4個時間點的變化趨勢不全相同（F=28.071，P＜0.01），同一時間點3組動物間不全相同（F=13.426，P＜0.01），時間與處理因素未見交互作用，即3組動物在4個時間點的變化趨勢未見差別（F=1.691，P=0.137）。模型組在8、24、48 h均高于假手術組，血必凈組在2、8、24、48 h均低于模型組（均P＜0.01），見表3。

Tab.3 Changes of renal MIF mRNA expression in each group表3 各組大鼠腎組織MIF mRNA表達的變化 （±s）

Tab.3 Changes of renal MIF mRNA expression in each group表3 各組大鼠腎組織MIF mRNA表達的變化 （±s）

組別假手術組模型組血必凈組F 2 h 1.08±0.04 1.54±0.54 1.22±0.40B4.940＊8 h 1.33±0.79 2.56±1.19A2.13±0.86aB5.021＊24 h 1.87±0.72 3.97±1.67Aa2.26±0.63aB5.911＊48 h 2.98±0.78abc6.08±2.17Aabc4.70±1.12aBbc5.120＊F 6.467＊＊13.380＊＊27.850＊＊-

3 討論

AKI是膿毒癥及膿毒癥休克患者最常見、最嚴重的并發癥之一，腎臟功能輕度損傷即可造成膿毒癥患者病死率的增加，是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[5]。多項研究表明膿毒癥中的炎癥因子可直接導致腎臟損傷[6]。既往的研究往往多靶向于膿毒癥發病的早期炎癥因子，而事實上對膿毒癥患者進行治療時，整個膿毒癥過程的級聯反應可能已經啟動，因此國外一些研究機構開始尋找晚期炎癥因子，以期擴大膿毒癥治療的時間窗。

Al-Abed等[7]在針對MIF抑制劑的研究中指出，MIF作為晚期炎癥因子參與了膿毒癥的發病，應用MIF抑制劑干預后，MIF的表達受到有效抑制，阻斷了膿毒癥的發生與發展，并不同程度地減輕了器官損害，對預后具有明顯的改善作用。目前已有多項研究表明：在膿毒癥的急性期，血清MIF水平的高低與膿毒癥嚴重程度呈正相關[8]。另有研究表明：細菌內毒素或腫瘤壞死因子（TNF）均可誘導垂體前葉細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞等釋放MIF，通過細胞外調節激酶（EPK）途徑誘導胞漿磷脂酶A2(cytoplasmic phospholipaseA2,CPLA2)的磷酸化并活化[9]，最終導致花生四烯酸釋放，花生四烯酸又能激活和促進TNF-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥因子表達、一氧化氮釋放，造成組織、器官損害[10]。腎臟作為炎癥因子攻擊的靶器官之一，極易發生損傷。但目前有關膿毒癥急性腎損傷過程中MIF表達的變化規律，及其與急性腎損傷的關系和藥物有效干預的研究甚少。本研究結果顯示：假手術組腎臟組織及血清中MIF有基礎水平的表達，模型組大鼠CLP后血清MIF濃度24 h明顯升高，48 h仍高于假手術組，具有產生較晚、下降緩慢的“晚期炎癥因子”特征。與假手術組相比，模型組腎組織MIF mRNA的表達于CLP后8 h顯著增強，提示腎臟功能障礙的血清Cr水平于CLP后24 h顯著升高，提示MIF可能在誘導膿毒癥大鼠急性腎損傷過程中發揮了重要作用，其致病過程可能與MIF吸引巨噬細胞侵潤腎臟組織、誘導其釋放大量炎性因子造成組織損傷有關。

血必凈注射液是復方中藥制劑，由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸5味中藥組成，其主要有效成分包括紅花色素、酚酸、黃酮苷和苯乙基苷類等[11]。該藥是王今達教授根據“菌、毒、炎”并治理論自主開發用于治療膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）的有效藥物，目前已廣泛應用于急危重癥的臨床救治。研究表明血必凈注射液具有拮抗內毒素、炎癥因子以及維持正?？垢腥久庖叩茸饔?，可通過多途徑、多靶點、多環節效應阻止膿毒癥發展、達到臟器保護作用，在膿毒癥治療中占有重要的地位。但目前有關血必凈注射液對膿毒癥性急性腎損傷中MIF表達的影響少見報道。本研究可見：CLP造模后采用血必凈注射液干預可有效抑制腎組織MIF mRNA的合成，并下調大鼠血清MIF水平。與模型組相比，血必凈組大鼠腎組織MIF mRNA表達在2、8、24、48 h明顯下降，血清MIF水平在24、48 h也明顯降低，表明血必凈對膿毒癥晚期炎癥因子MIF的異常表達具有下調作用，從而可能有助于防止失控性炎癥反應的進一步發展。應用血必凈后大鼠血清Cr水平亦明顯下降，表明血必凈可能通過下調MIF的合成與釋放，有效地預防炎癥反應的發生、發展，從而達到保護腎臟的作用。

綜上，MIF作為新的“晚期”炎癥因子參與膿毒癥的致病過程，通過吸引巨噬細胞侵潤、促進多種炎癥因子分泌造成腎臟損傷，因此血清MIF可能成為膿毒癥急性腎損傷重要的生物標志物和治療靶標。同時本課題研究發現血必凈注射液可通過抑制晚期炎癥因子MIF的合成與釋放，進而阻止腎損傷的發生與發展，為臨床預防和治療膿毒癥急性腎損傷開辟了新途徑。

[1]Dennen P,Douglas IS,Anderson R.Acute kidney injury in the intensive care unit:an update and primer for the intensivist[J].Crit Care Med,2010,38(1):261-275.

[2]Zarjou A,Agarwal A.Sepsis and Acute Kidney Injury[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(6):999-1006

[3]Jing L，Bu M．Role of macrophage migration inhibitory factor in glucocorticoid release and glucocorticoid receptor function in rats[J].Ann Clin Lab Sci,2011,41(1):14-19．

[4]Chaudry IH,Wichterman KA,Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels[J].Surgery,1979,85(2):205-211

[5]Kim WY,Huh JW,Lim CM,et al.A comparison of acute kidney injury classifications in patients with severe sepsis and septic shock[J]. Am J Med Sci,2012,344(5):350-356.

[6]Leelahavanichkul A,Huang Y,Hu X,et al.Chronic kidney disease worsens sepsis and sepsis-induced acute kidney injury by eleasing High MobilityGroup Box Protein-1[J].Kidney Int,2011,80(11): 1198-1211.

[7]Al-Abed Y,Dabideen D,Aljabari B,et al.ISO-1 binding to the tautomerase active site of MIF inhibits its pro-inflammatory activity and increases survival in severe sepsis[J].J Biol Chem,2005,280(44): 36541-36544．

[8]Dirkes S.Sepsis and inflammation:impact on acute kidney injury[J]. Nephrol Nurs J,2013,40(2):125-132.

[9]Bozza MT,Martins YC,Carneiro LA,et al．Macrophage migration inhibitory factor in protozoan infections[J]．J Parasitol Res,2012, 2012:413052．

[10]Alam A,Pal C,Goyal M,et al.Synthesis and bio-evaluation of human macrophage migration inhibitory factor to develop anti-inflammatory agent[J].Bioorg Med Chem,2011,19(24):44-47．

[11]Qi F,Liang ZX,She DY,et al.A clinical study on the effects and mechanism of xuebijing injection in severe pneumonia patients[J].J Tradit Chin Med,2011,31(1):46-49.

（2014-03-09收稿 2014-06-17修回）

（本文編輯 李國琪）

Effect of Xuebijing Injection on MIF Expression and Acute Kidney Injury in Rats with Sepsis

WANG Yongming1,QIAO Youjie2△,LI Jiarui1,SHANG Yuefeng1,YOU Picong1
1 Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China;2 Tianjin Union Medical Center△

E-mail：Youjieq@Yahoo.com

ObjectiveTo investigate the expression of macrophage migration inhibitory factor(MIF)in serum and renal tissue of septic rats with actue kidney injury(AKI),and to explore the effect of Chinese traditional medicine-Xuebijing injection on MIF expression as well as on acute kidney injury in rats with sepsis.MethodsSepsis model was reproduced in rats with cecal ligation and puncture(CLP)．Eighty healthy SD rats were randomly divided into three groups：sham operation group（n=16）,CLP model group(n=32),and xuebijing group(n=32)．All rats were sacrificed at either 2,or 8,or 24 and or 48 hours after operations．MIF mRNA levels in renal tissues of septic rats were semi-quantified by Real-time PCR．The content of MIF in serum was determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Serum creatinine(Cr)contents were measured by automatic biochemistry analyze.ResultsCompared with sham operation group,transcription of MIF mRNA in renal tissues of model group were significantly enhanced at 8,24 and 48 hours after operations(P＜0.01).Both contents of MIF and creatinine level in serum of model group rose obviously at 24 and 48 hours after operation(P＜0.01)；Compared with model group,the transcription of MIF mRNA in renal tissues of xuebijing group decrease obviously at 2,8, 24 and 48 hours(P＜0.01)and both contents of MIF and creatinine in serum of xuebijing group drop remarkably at 24 and 48 hours(P＜0.01).ConclusionMIF is a kind of late cytokine which might participate in the pathogenesis of AKI in rats with sepsis．Xuebijing injection can inhibit MIF expression,and possess the protective effects on the kidney in rats with sepsis.

sepsis;macrophage migration inhibitory factor;acute kidney injury;xuebijing injection;creatinine

R631

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.008

天津市衛生局科技基金項目（2012KY22）

1天津市天津醫院ICU科（郵編300211）；2天津市人民醫院ICU科

△通訊作者 E-mail：Youjieq@Yahoo.com