三苯基錫和三丁基錫對海膽的急性毒性研究

夏重大+王媛+柴曉杰+叢玉婷+王麗

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.06.002

摘 要：采用發育生物學和生態毒理學的模式生物海膽檢測兩種典型的有機錫化合物三苯基錫(TPT)和三丁基錫(TBT)對水生生物的急性毒性，同時對上述物質對海膽的安全性進行初步評估，以期為有機錫的防控提供基礎數據。半靜水條件下，通過概率單位法（Bliss）得到TPT和TBT對黃海膽24 h，48 h，72 h，96 h的LC50，分別為：25.007、18.743、9.514、6.662 μg?L-1和19.850、15.986、7.888、4.916 μg?L-1，并計算TPT和TBT對海膽的安全濃度分別為0.666和0.492 μg?L-1。結果發現，TPT和TBT對黃海膽均表現為劇毒作用，TBT毒性大于TPT。海膽對上述毒物具有很高的敏感性，結果穩定，重現性好，建議將海膽作為海洋環境中有機錫污染的監測生物。

關鍵詞：黃海膽；三丁基錫；三苯基錫；急性毒性；安全質量濃度

有機錫化合物是一種典型的持久性有機污染物，其作為重要的化工、紡織、農藥等的原料，被廣泛應用于工農業生產中[1]。但有機錫化合物具有高毒性，包括“三致”（致癌、致畸、致突變）、生殖毒性、神經毒性和內分泌干擾特性等，在環境中持久存在，并可通過生物食物鏈（網）累積而對人類健康及環境造成有害影響[2]。迄今為止，有機錫化合物是人為引入海洋的毒性最大的物質之一，其主要來源是有機錫農藥和海洋防污涂料[3]。聯合國國際海事組織決定到2008年1月，禁止所有船舶使用含有機錫的防污涂料。即便如此，有機錫化合物仍將長期滯留于海洋中，對海洋生物造成毒害，使海洋環境遭到巨大破壞。通過黃海膽抗脂質過氧化丙二醛(MDA)致死含量，可以作為監測海洋TPT污染的生物標志物[4]。我國海洋環境中已經檢測出高于國際制定標準的有機錫，特別是在海河河口及與相鄰的渤海灣地區，存在較嚴重的有機錫污染[5]。目前，有機錫的海洋生態毒理效應研究已成為國內外共同關注的熱點。

據報道，環境中極低含量的有機錫即能對生物產生毒性影響。存在于海洋環境中毒性較高的三苯基錫(Triphenyltin Chloride ,TPT)和三丁基錫(Tributyltin Chloride ,TBT)對敏感物種，如牡蠣、貽貝和部分甲殼類動物等的急性致死濃度為0.64～16 μg?L-1 (以Sn計)[6]。研究表明，有機錫具有神經、生殖發育及遺傳毒性。TBT能抑制神經遞質生成，對動物的行為產生影響，有機錫是一類內分泌干擾物質，它能影響生物的生殖功能，干擾體內激素的分泌造成生殖和遺傳的不良后果，0.3 μg?L-1 時可對絕大多數水生生物產生明顯的內分泌毒性，例如導致腹足類水生動物雌性個體產生明顯雄性特征，嚴重時可導致性別比例失調，種群衰退[7]。盡管如此，目前對有機錫生態毒理的認識還不十分清楚，有待進一步深入。

海膽屬棘皮動物門(Echinodermata)、海膽綱(Eehinoidea)[8]，它個體較小，但生命力極強，能適應多變的環境，在日本、加拿大和美國等國家已廣泛將其作為模式生物用于檢測重金屬的毒性及監測海洋環境的污染狀況[9]。本文以大連黃海膽（Glyptocidaris crenularis）為實驗動物，研究了兩種典型有機錫—三苯基錫和三丁基錫對海膽急性毒性效應，并評估了兩種有機錫作用的安全濃度。研究結果可為經濟水產動物海膽的養殖水體環境監測提供參考數據，同時對海洋環境有機錫化合物污染的監測和防控具有一定的理論意義和參考價值。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：pH計(HORIBA pH/ION METER F-24)，溶解氧測定儀(METTLER TOLEDO)，電子分析天平(AE240， Mettler-toledo )；高壓滅菌鍋(SM-52-2, Yamato)；試劑見表1。

表1 試劑

化學品名稱 分子式 來源 純度

TPT (C6H5)3SnCl sigma公司 95%

TBT (C4H9)3SnCl sigma公司 96%

1.2 實驗材料

實驗動物：大連黃海膽，殼徑（6.0±0.4）cm，購于大連長興海鮮市場。正式實驗之前，轉入與實驗用水質、溫度和光照相同的靜水養殖系統中適應7 d，以使海膽適應實驗室的生活環境，如水溫、水質和光照等，且便于對實驗海膽進行健康選擇。每3天投喂1次（裙帶菜）。在馴養期內，動物的死亡率不得超過5%。選擇的健康個體，即選擇活動頻繁，棘刺管足正常，未受任何疾病感染的個體。

1.3 實驗條件

水質:海水，pH值7.8±0.5，鹽度（32.2±03）‰，水溫（22.5±1） ℃；光照為自然光照；負荷為每升水放海膽＜1.0 g；試驗周期為96 h；試驗方式為半靜態 (24 h全部更換受試液) 。

1.4 實驗方法

參照《國家環保局化學品測試準則》的方法進行試驗[10]。配制試驗溶液時，TPT和TBT不易溶解于水，以丙酮為助溶劑配制儲備液。試驗時用蒸餾水將儲備液稀釋成試驗所需濃度。實驗在10 L的培養箱中進行。每個培養箱中放入10個暫養健康的海膽，量其體長并作記錄。試驗設置4平行系列，同時設置空白對照和助溶劑對照。連續觀察受試對象的活動狀況，同時觀察其中毒癥狀表現，如棘刺有無脫落、有無排泄物、外表有無變色、殼體是否貼壁良好等。以用鑷子多次碰觸軀體完全無反應作為死亡判斷標準，及時取出死亡個體，每隔12 h 觀察1次，每隔24 h換受試液一次，試驗時間為96 h。為減少誤差，試驗前用對應的藥物質量濃度浸泡實驗容器12 h 以上。

1.5 數據處理

根據有機錫對海膽的急性毒性試驗結果，利用SPSS 17.0 軟件中的Probit 命令分別建立不同觀察時段的死亡概率單位—質量濃度直線回歸方程，分別求出各相應觀察時段的半致死濃度，并計算有機錫的安全濃度：安全濃度SC＝0.1×96 h LC50。

2 結果

2.1 實驗動物中毒癥狀

在低劑量組，24 h內海膽活動狀況與對照組幾乎無任何區別，全部貼壁，棘刺和管足反應迅速，有少量絲狀排泄物；48 h后活動能力逐漸遲緩，個別棘刺出現脫落，貼壁不緊，出現死亡，培養箱內均出現長絲狀絮狀排泄物；隨著染毒時間的延長，72 h時大多數個體貼壁不緊，棘刺脫落嚴重，接近半數個體死亡，長絲狀絮狀排泄物更加明顯；96 h時，存活個體，出于亞致死狀態，棘刺脫落嚴重，管足幾乎不動，超過半數死亡。在高劑量組，海膽對毒物反應敏感，到48 h時，大多海膽的口和齒緊閉，貼壁不緊，少數出現棘刺掉脫光，接近半數死亡，絲狀排泄物多；72 h時超過半數海膽死亡，棘刺掉光；96 h時，幾乎全部個體死亡。實驗過程中，海膽隨染毒濃度的增加，身體暗紅色加深；所有死亡海膽圍口膜及個體暗紅，圍口膜更加明顯。

2.2 有機錫對海膽急性毒性效應

由表2可知，丙酮溶劑對照組和自然海水對照組在96 h均無死亡情況出現，并且活力正常。低濃度組（TPT：5.6，7.5 μg?L-1；TBT：4.6，52 μg?L-1）在96 h 內均出現半數死亡；高濃度組在72 h 的死亡率很高，隨著時間的延長死亡率逐漸增加。從結果來看，海膽對兩種有機錫最初具有一定的耐受性，隨時間的增加，72 h均出現死亡率變化最大，96 h變化趨于緩慢。TPT/TBT對海膽的毒性效應均隨質量濃度的提高和時間的增加而明顯增強，表現出良好的時間-效應和劑量—效應。

表2 不同觀察時段有機錫對

海膽的急性毒性的累積死亡率

藥品 劑量/μg?L-1 24 h/% 48 h/% 72 h/% 96 h/%

TPT

TBT

對照組(CK) 0 0 0 0

5.6 0.00 0.17 0.28 0.44

7.5 0.00 0.22 0.39 0.50

10.0 0.00 0.28 0.50 0.78

13.5 0.06 0.39 0.67 0.89

18 0.17 0.50 0.78 1.00

4.2 0.00 0.00 0.20 0.44

5.6 0.00 0.06 0.33 0.50

7.5 0.00 0.17 0.52 0.78

10.0 0.11 0.22 0.56 0.90

13.5 0.17 0.33 0.71 0.94

2.3 有機錫在海膽體內的蓄積及其安全質量濃度評價

由表3 可知，TPT和TBT對黃海膽24 h，48 h，72 h，96 h的LC50，分別為：25.007、18.743、9514、6.662 μg?L-1和19.850、15.986、7.888、4.916 μg?L-1。LC50隨試驗時間的延長而減少，表明有機錫的致毒能力均隨試驗時間的延長而明顯增強，說明其存在較為明顯的蓄積急性致毒效果。

有機錫對海膽的毒性作用可根據其急性中毒試驗的96 h的LC50分為4級[11]：劇毒、高毒、中毒、低毒，TPT和TBT對海膽均為劇毒，海膽對有機錫污染十分敏感。

表3 不同觀察時段有機錫對海膽成體急性毒性特征的分析

藥品 時間/h 回歸方程 P χ2 N LC50/

μg?L-1 LC5095%置

信區/μg?L-1 SC/μg?L-1

TPT

TBT

24 Y=6.485x-9.067 0.997 0.202 40 25.007 n.c.

48 Y=1.925x-2.450 0.995 0.070 40 18.743 12.945～27.101

72 Y=2.695x-2.637 0.996 0.057 40 9.514 7.003～12.376

96 Y=4.373x -3.602 0.647 1.655 40 6.662 4.949～7.868TBT

24 Y=4.251x-5.517 0.930 0.448 40 19.850 14.146～ 30.606

48 Y=2.744x-3.302 0.566 2.209 40 15.986 11.520～25.282

72 Y=3.113x-2.793 0.920 0.493 40 7.888 6.303～10.123

96 Y=3.718x-2.571 0.857 0.768 40 4.916 3.358～5.954

0.666

0.492

3 討論

黃海膽是營養極其豐富的海珍品之一，通過商業活動供人類食用。有機錫在海膽體內的富集和傳遞對人體健康具有潛在的風險。因此研究海洋生物中有機錫富集狀況對控制海洋環境的有機錫污染和保護人體健康具有重要意義。

在本試驗過程中觀察到，在正常情況下，海膽外殼呈黃褐色，染毒后，體色加深，死亡時，身體暗紅，圍口膜處尤其明顯。據報道，紫球海膽在體壁發生感染時，可產生由大量紅色桑椹細胞的聚集而引起感染部位變成黑色或暗紅色環狀組織的現象[12]。本實驗發現大連黃海膽染毒后身體顏色與發生感染的紫球海膽相似。棘皮動物通過非特異性免疫系統進行免疫應答，由體腔細胞和多種體液免疫因子共同介導[13]，直接作用于入侵病原體。作為參與免疫反應的主要體腔細胞[14]，吞噬細胞和桑椹細胞具有趨化性，在組織受損，聚集于該部位發生浸潤現象[15]。本實驗可以推測，大連黃海膽體細胞中可能含有紅色桑葚細胞，有機錫化合物通過海膽攝食進入體內，引發機體發生非特異性免疫反應，產生大量紅色桑椹細胞聚集于受損組織，引起感染部位變成暗紅色。有報道稱有機錫能使生物體神經系統在分子和細胞水平發生改變，同時抑制神經遞質，對動物的行為產生影響。海膽在正常情況下，外殼上棘刺和管足自動伸縮。染毒后，棘刺逐漸脫落，吸附能力下降，對外界刺激反應遲鈍。我們認為海膽反應遲鈍可能是有機錫化合物作用于神經傳導通路，抑制了海膽行為。

有機錫種類繁多，化學結構不同，其毒性同類化合物中烷基錫的毒性大于芳基錫。本研究發現，TBT對海膽的毒性高于TPT，此研究與已有的報道相一致[16-17]。鑒于TBT對同一生物的毒性比TPT的毒性高，從TBT對生物的毒性來看，TBT對海膽96 h的LC50為4.916 μg?L-1，此結果高于TBT對鯉魚96 h的LC50 (3.150 μg?L-1)和油鯡96 h的LC50 ( 1.88 μg?L-1)[18]。這說明與魚類相比， 海膽對有機錫還是有一定的耐受性，究其原因，可能是魚鰓比海膽圍口鰓發達，毒物吸收快，且海膽石灰質的外殼增強了對毒物的抗性。

目前我國港口水域有機錫化合物污染問題已相當嚴重，特別是近海(港灣和內河港口)，有機錫化合物濃度已大大超出一些國家的環境質量標準。由于海膽等水生生物對有機錫化合物的降解慢，富集系數高[19]，如長期暴露于有機錫化合物污染，可能在此有機錫化合物濃度下就會對有機錫化合物造成慢性毒性效應，進而很有可能造成海膽的死亡或種群衰退。通過試驗發現，海膽對上述毒物具有較好的敏感性，結果穩定，重現性好，建議將海膽作為水體環境中有機錫污染的監測生物。

參考文獻：

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[18] 張寶東,張毓琪,陳敘龍.氯化三丁基錫對鯉魚的急性毒性[J].交通環保,1995,16 (1):18-19

[19] 顏天,李正炎,等.三苯基氯化錫對海灣扇貝攝食、附著和存活的影響[J].水產學報,2001,25(3):279-282

Acute toxicity of Tributyltin Chloride and

Triphenyltin Chloride on Sea urchin

XIA Zhong

________________________________________

da, WANG Yuan,CHAI Xiao

________________________________________

jie,CONG Yu

________________________________________

ting, WANG Li

(Liaoning Key Laboratory of Hydrobiology, College of fisheries and life science, Dalian ocean university, Dalian 116023,China)

Abstract：We detected the acute toxicity of two typical organotin compound tributyltin chloride（TBT) and triphenyltin chloride(TPT) on aquatic organisms by using Glyptocidaris crenularis, the model organism for developmental biology and ecotoxicology under semi-hydrostatic conditions, and assessed the security of organotin at the same time, in order to provide the basic data for the prevention and control of organotin. Results showed that the LC50 of 24 h，48 h ，72 h and 96 h of TPT and TBT to Glyptocidaris crenularis were 25.007、18.743、9.514、6.662 μg?L-1 and 19.850、15.986、7.888、4916 μg?L-1 ，respectively .Their safe concentration were 0.666,0.492 μg?L-1 ，respectively.Both TPT and TBT were highly toxic to Glyptocidaris crenularis, the TBT toxicity were bigger than TPT.The sea urchin had a very high sensitivity of these poisons, the results were stable, with good reproducibility.Ｗe suggest sea urchin as the modelorganism to monitor organotin contamination in the marine environment.

Key words：Glyptocidaris crenlaris；tributyltin chloride（TBT）；triphenyltin chloride(TPT)；acute toxicity；safe concentration

（收稿日期：2014-03-09）《河北漁業》2014年第6期(總第246期)

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Acute toxicity of Tributyltin Chloride and

Triphenyltin Chloride on Sea urchin

XIA Zhong

________________________________________

da, WANG Yuan,CHAI Xiao

________________________________________

jie,CONG Yu

________________________________________

ting, WANG Li

(Liaoning Key Laboratory of Hydrobiology, College of fisheries and life science, Dalian ocean university, Dalian 116023,China)

Abstract：We detected the acute toxicity of two typical organotin compound tributyltin chloride（TBT) and triphenyltin chloride(TPT) on aquatic organisms by using Glyptocidaris crenularis, the model organism for developmental biology and ecotoxicology under semi-hydrostatic conditions, and assessed the security of organotin at the same time, in order to provide the basic data for the prevention and control of organotin. Results showed that the LC50 of 24 h，48 h ，72 h and 96 h of TPT and TBT to Glyptocidaris crenularis were 25.007、18.743、9.514、6.662 μg?L-1 and 19.850、15.986、7.888、4916 μg?L-1 ，respectively .Their safe concentration were 0.666,0.492 μg?L-1 ，respectively.Both TPT and TBT were highly toxic to Glyptocidaris crenularis, the TBT toxicity were bigger than TPT.The sea urchin had a very high sensitivity of these poisons, the results were stable, with good reproducibility.Ｗe suggest sea urchin as the modelorganism to monitor organotin contamination in the marine environment.

Key words：Glyptocidaris crenlaris；tributyltin chloride（TBT）；triphenyltin chloride(TPT)；acute toxicity；safe concentration

（收稿日期：2014-03-09）《河北漁業》2014年第6期(總第246期)

[9] Semenova M N,Kiselyov A ,Semenov V V. Sea urchin embryo as a model organism for the rapid functional screening of tubulin modulators [J]. BioTechniques,2006,40:765-774

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[15] David A R,Jeunifer R,Rebecca A N,et al.A complement component C3-like peptide stimulates chemotaxis by hemocytes from an invertebrate chordate,the tunicate,Pyura stolonifera [J].Comp Biochem Physiol,2003,134(2):377-386

[16] 孫紅文,黃國蘭,李書霞,等.三苯基錫和三丁基錫對大型蚤(Daphnia magna)的毒性作用研究[J].環境化學,2000,19(3):325-239

[17] 徐明德,杜春梅.有機錫對金藻的毒性效應[J].黃渤海海洋,2001,19(1):66-69

[18] 張寶東,張毓琪,陳敘龍.氯化三丁基錫對鯉魚的急性毒性[J].交通環保,1995,16 (1):18-19

[19] 顏天,李正炎,等.三苯基氯化錫對海灣扇貝攝食、附著和存活的影響[J].水產學報,2001,25(3):279-282

Acute toxicity of Tributyltin Chloride and

Triphenyltin Chloride on Sea urchin

XIA Zhong

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da, WANG Yuan,CHAI Xiao

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jie,CONG Yu

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ting, WANG Li

(Liaoning Key Laboratory of Hydrobiology, College of fisheries and life science, Dalian ocean university, Dalian 116023,China)

Abstract：We detected the acute toxicity of two typical organotin compound tributyltin chloride（TBT) and triphenyltin chloride(TPT) on aquatic organisms by using Glyptocidaris crenularis, the model organism for developmental biology and ecotoxicology under semi-hydrostatic conditions, and assessed the security of organotin at the same time, in order to provide the basic data for the prevention and control of organotin. Results showed that the LC50 of 24 h，48 h ，72 h and 96 h of TPT and TBT to Glyptocidaris crenularis were 25.007、18.743、9.514、6.662 μg?L-1 and 19.850、15.986、7.888、4916 μg?L-1 ，respectively .Their safe concentration were 0.666,0.492 μg?L-1 ，respectively.Both TPT and TBT were highly toxic to Glyptocidaris crenularis, the TBT toxicity were bigger than TPT.The sea urchin had a very high sensitivity of these poisons, the results were stable, with good reproducibility.Ｗe suggest sea urchin as the modelorganism to monitor organotin contamination in the marine environment.

Key words：Glyptocidaris crenlaris；tributyltin chloride（TBT）；triphenyltin chloride(TPT)；acute toxicity；safe concentration

（收稿日期：2014-03-09）《河北漁業》2014年第6期(總第246期)