膠原神經再生室復合CNTF修復周圍神經損傷的作用

王宇博，丁新玲，張春光

（赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000）

膠原神經再生室復合CNTF修復周圍神經損傷的作用

王宇博，丁新玲，張春光

（赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000）

目的：討論應用膠原蛋白制備神經再生室復合CNTF（睫狀神經營養因子）修復外周神經缺損的效果.方法：選取30只SD大鼠，隨機分為三組，A組膠原神經再生室復合CNTF組、B組單純膠原神經再生室組、C組原位神經移植組.術后不同時期進行大體觀察,并于術后16周進行電生理、組織學、電鏡觀察及圖像分析方法評價神經再生效果.結果：術后16周A和C組的神經傳導速度比較差異無統計學意義，均優于B組，且差異有統計學意義（P＜0.05）；再生神經纖維數目、直徑及髓鞘厚度的比較，A和C組比較差異無統計學意義，均優于B組，且差異有統計學意義（P＜0.05）.結論：應用膠原神經再生室復合CNTF是一種有效的修復周圍神經缺損的方法.

膠原；再生室；CNTF；周圍神經損傷

目前認為應用神經再生室修復是周圍神經損傷是一種較好方法，而用于制作神經再生室材料的選擇中，復合型材料的研究日漸增多.膠原蛋白是細胞外基質的重要組成部分，被證實是制備神經再生室較為合適的天然材料[1]，本實驗利用膠原神經再生室復合CNTF橋接損傷神經兩斷端，并觀察其對神經再生的作用.

1 材料與方法

1.1 神經再生室的制備：

利用10gI型膠原蛋白（美國sigma公司）制備成長約12mm長度的膠原神經再生室，將制備好的膠原神經再生室放入-80℃冰箱冷凍過夜,取出后真空冷凍干燥24小時，取出放入2%京平尼溶液中，置于37℃溫箱中交聯，自然干燥后放置于-4℃環境下保存，以上操作在無菌條件下進行.

1.2 動物分組和模型制備

選取30只SD大鼠，隨機分為A、B、C三組，每組10只.使用10%水合氯醛（0.3ml/100g）行腹腔麻醉，無菌條件下暴露坐骨神經，三組均造成約10mm的神經缺損，A組用膠原神經再生室橋接神經缺損兩斷端各1mm,并向再生室內注入含50μg/ mlCNTF，B組用膠原神經再生室橋接神經缺損兩斷端各1mm后在再生室內注入生理鹽水，C組自體神經原位移植，手術完畢縫合切口.

1.3 實驗項目

（1）實驗動物觀察：術后常規觀察實驗動物的切口愈合、足部皮膚改變及患肢情況.術后16周,觀察神經再生室降解以及坐骨神經再生情況.（2）電生理監測：手術后16周，原位暴露坐骨神經，將記錄電極刺入小腿三頭肌,刺激電極依次置于再生神經兩端,刺激神經，對三組實驗動物的神經傳導速度進行測定.（3）光鏡觀察：將再生神經由4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后行H-E染色，鏡下觀察再生神經的結構及形態.（4）電鏡觀察:從再生神經遠段取材,20g/L戊二醛固定,Epon812定向包埋,連續橫切片,鈾-鉛雙染,透射電鏡觀察神經再生情況.（5）采用圖像分析系統：計算三組遠端再生神經纖維數目、再生神經纖維直徑及髓鞘厚度進行比較.

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 大體觀察

術后三組大鼠術后切口均愈合良好，患肢拖行，無疼痛反應.術后第2周開始三組大鼠均出現不同程度的足部腫脹，第3周三組陸續出現足部皮膚潰瘍，以B組最重，第8周三組大鼠，足部潰瘍基本愈合，B組足部潰瘍愈合略晚；第16周按原切口，暴露坐骨神經，A、B組再生室降解變薄，A組再生神經較B組略粗，與兩端神經連接良好，無明顯的結締組織增生，與周圍組織沒有明顯粘連，C組自體神經移植處兩端膨大隆起，可見結締組織增生.

2.2 神經電生理測定結果

術后16周，各組實驗動物的神經傳導速度均有所恢復，A與C組神經傳導速度比較差異無統計學意義（P＞0.05），均優于B組，且差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表1.

表1 術后16周神經傳導速度比較（±s）

表1 術后16周神經傳導速度比較（±s）

分組 n 運動神經傳導速度（m/s）A組B組C組10 10 10 18.57±3.56 15.36±4.09 22.18±3.35

2.3 光鏡觀察

術后16周行HE染色后光鏡下觀察可見，三組再生神經均長入遠端，A組及B組有髓神經纖維數目多，排列規整而密集，軸突和髓鞘成熟度較好，束間結締組織較少，均優于C組.

2.4 電鏡觀察

A組和C組再生神經數目較多，神經纖維直徑較為規整，髓鞘厚度較均勻一致，B組再生神經數目較其他兩組少，神經纖維直徑粗細不等，髓鞘厚度不均勻.

2.5 圖像分析

對三組實驗動物的遠段處進行圖像分析顯示，單位面積再生神經纖維數、再生神經纖維直徑及髓鞘厚度，A和C組比較差異無統計學意義（P＞0.05），均優于B組，且差異有統計學意義（P＜0.05），見表2.

表2 術后16周三組再生神經纖維數目、再生神經纖維直徑及髓鞘厚度比較（±s）

表2 術后16周三組再生神經纖維數目、再生神經纖維直徑及髓鞘厚度比較（±s）

組別 n 神經纖維數目（根）神經纖維直徑（μm）髓鞘厚度（μm）A組B組C組10 10 10 3589.36±319.26 3315.69±353.52 3675.82±506.31 4.05±0.36 3.53±0.23 4.17±0.31 0.45±0.02 0.36±0.05 0.49±0.07

3 討論

隨著顯微外科技術的發展，對于周圍神經損傷的研究得到了很大的進展.復合神經材料制備再生室橋接神經缺損是目前研究的熱點，多種材料復合制備再生室可以整合每種材料的優點，從而對周圍神經損傷達到更好的修復效果.

膠原蛋白是細胞外基質的重要組成部分，組織相容性好，無免疫原性，能有效的促進軸突的再生以及雪旺細胞向損傷處遷移，是制備神經再生室較為理想的材料[2-3]，但是膠原蛋白在體內環境下降解速度較快，不利于神經軸突的通過，所以本實驗選用京平尼對膠原蛋白進行交聯，京平尼是中藥中杜仲所含物質，對人體無毒副作用，交聯后能降低膠原蛋白的降解速度，有益于神經在再生室內生長[4].CNTF對于神經和肌肉的作用被人們所重視，CNTF可以促進軸突通過再生室，增加軸突數目以及髓鞘的形成[5]，同時有研究表明CNTF能通過促進運動神經軸突的再生，能夠使支配區域的肌肉功能有較好的恢復作用[6-7].

應用膠原蛋白制備神經再生室，可以為神經軸突的再生提供良好“微環境”，而神經損傷時遠端神經的雪旺細胞內CNTF減少，本實驗在膠原神經再生室內添加外源性CNTF，與膠原蛋白共同促進神經軸突再生，增加軸突數目及成熟度，術后16周觀察可見膠原神經再生室已經基本降解，再生神經由近端長入遠端，在神經電生理檢測，形態學觀察以及圖像分析的結果中顯示膠原神經再生室復合CNTF要優于單純膠原神經再生室，與自體神經移植無明顯差異，說明膠原蛋白復合CNTF制備再生室能夠較好的橋接外周神經缺損，在今后研究中應該繼續的尋求適宜的再生室厚度、彈性及通透性，促使CNTF吸附在再生室壁內，通過再生室逐步降解達到緩釋CNTF的效果.

〔1〕XIAO Yu-liang,ZHENG Lian-ying，HAN Jun-fen,eta1.Researchprogressioninco Hagen protein[J].Journal of Taishan Medical CoHege，2005，26(5)：493-497.

〔2〕KitaharaAK,Suzukiy,Peng Q,etal.Facialnerverepairusingcollagennerveconduit incats [J].Scand JPlast Reconstr Surg Hand Surg,1999,33(2):1872193.

〔3〕MatsumotoK，NakamuraT，ShimizuY，eta1.A novelSurgicalmaterialmade from collagen with high mechanicalstrength： A collagen sandwichmembrane明.ASAIOJ，1999，45(4)：288—292.

〔4〕Chen YS，ChangJY，ChengCY，eta1.Anin vivo evaluation ofabiodegradablegenipincross——linkedgelatinperipheralneverguide conduitmaterial[J].Biomaterials，2005，26(3)：391 1—3918.

〔5〕NewmanJP.Ciliaryneurotrophicfactoren.hances peripheralnerveregeneration.Archotolyaryngol Head Neck Surg，1996，122：399.

〔6〕Mc Callister WV.Tang P.Axonal regeneration stimulatedbythecombinationofnervegrowt hfactoran d ciliary neurotrophicfactorin an end-to-sidemode1.JHand Surg[Am]，2001，26：478-488.

〔7〕IpFC，FuAK，Tsim KW.eta1.Differen.tialexpressionofciliaryneurotrophicfactorreceptor inskeletalmuscleofchickandratafternerve injury.JNeuroch～n，1996，67：1607—1612.

R651.3

A

1673-260X（2014）03-0038-02