參 麥 注 射 液 對 早 產 腦 損 傷 仔 鼠 腦 組 織 GAP-43 和IL-21 表達的影響

王冬 周慧茹

參 麥 注 射 液 對 早 產 腦 損 傷 仔 鼠 腦 組 織 GAP-43 和IL-21 表達的影響

王冬 周慧茹

目的 從宮內感染致早產的仔鼠腦組織中神經生長相關蛋白 (GAP-43)和白介素 21(IL-21)的表達方面研究參麥的腦損傷保護機制。方法 采用孕鼠腹腔注射脂多糖造成宮內感染模型 , 將早產仔鼠隨機分為 ：模型組、神經節苷脂組、參麥組、聯合組 , 腹腔注射生理鹽水組所生仔鼠為對照組 , 每組保證成活 8 只。7 日齡時開始分組用藥 ：模型組予生理鹽水腹腔注射 , 神經節苷脂組予申捷腹腔注射 , 參麥組予參麥注射液腹腔注射 , 聯合組予申捷聯合參麥注射液腹腔注射 , 共 14 d。21 日齡時取仔鼠腦組織 ,應用免疫組化方法對 GAP-43 和白介素 21 進行測定。結果 用藥組仔鼠腦組織中 GAP-43 表達增多、白介素 21 表達減少 , 其中聯合組療效優于神經節苷脂組和參麥組 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)。結論 參麥注射液對宮內感染致早產腦損傷仔鼠的腦保護作用可能與其促進腦組織中 GAP-43 表達增多、抑制白介素 21表達有關。

參麥 ；宮內感染 ；腦白質損傷 ；神經生長相關蛋白 ；白介素 21

腦癱是現代兒童致殘主要原因之一 , 隨著醫療技術的提高 , 早產成為腦癱最主要的致病因素。早產是圍產期諸多不良因素作用的結果 , 宮內感染導致的早產主要是由于感染引起的炎癥反應所致 , 諸多細胞因子參與其中 , 形成宮內感染 -細胞因子的釋放-腦白質損傷-腦癱鏈條。尋求有效預防或改善宮內感染所致的腦損傷的藥物、降低腦癱的發生率是基礎醫學和臨床醫學的重要研究課題。參麥注射液可改善心、肝、腦等主要臟器的供血［1］, 目前臨床上多用于缺血性心、腦血管疾病的治療。本研究旨在研究參麥注射液對宮內感染致早產幼鼠腦組織神經生長相關蛋白 (GAP-43)、白介素 21表達的影響 , 為參麥注射液治療早產兒腦損傷尋求實驗室證據。

1 材料與方法

1. 1 材料 清潔級成熟 Wistar大鼠由鄭州大學動物實驗中心提供。雌性大鼠 30只 , 平均體重 (250±20)g, 雄性大鼠 15只 , 平均體重 (280±20)g。常規飼養 , 飲食自由 , 12 h/12 h明暗周期 , 室溫恒定 21℃。1周后 , 16：00以 2:1合籠 , 次日 7:00行陰道脫落細胞涂片檢查 , 查得精子的孕鼠另籠飼養 , 檢查當日為孕第0天。

1. 2 主要試劑 脂多糖 (LPS)血清型、GAP-43試劑盒、白介素 21 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。參麥注射液 ：河北神威藥業有限公司生產 。申捷 ：神經節苷脂鈉注射液 , 吉林英聯生物制藥股份有限公司生產。

1. 3 模型制備及分組 將受孕大鼠隨機分為生理鹽水組(n=8只 )和 LPS組 (n=16只 ), LPS組 孕 鼠 于 孕 16 d腹 腔 注射 LPS 450 μg/(kg·d), 連續 2 d, 生理鹽水組腹腔注射同等劑量的生理鹽水 , 連續 2 d。孕 22 d前分娩的仔鼠為早產仔鼠。分娩后隨機選取兩組孕鼠各 2只 , 取胎盤行 HE染色觀察宮內感染情況。隨機選取生理鹽水組足月產仔鼠8只作為對照組 , 選取 LPS組早產仔鼠 32只 , 隨機分為參麥組、神經節苷脂組、聯合組、模型組等四組 , 每組 8只仔鼠。五組大鼠恒溫恒濕 , 母乳喂養 , 7日齡時開始腹腔注射用藥 ：參麥組予參麥注射液 8 ml/(kg·d), 神經節苷脂組予申捷 4 ml/(kg·d),聯合組予申捷聯合參麥注射液 (參麥注射液 8 ml/(kg·d)申捷 4 ml/(kg·d)；模型組予生理鹽水 4 ml/(kg·d), 共 14 d。21日齡時各組仔鼠均斷頭處死 , 取腦組織固定后石蠟包埋 , 4 μm切片厚度 , 應用免疫組化方法對 GAP-43和 IL-21進行測定。

1. 4 統計學方法 使用統計學軟件 SPSS13.0處理數據 , 計量資料以均數 ± 標準差 ( x-±s)表示 , 采用 t檢驗 , 采用單因素方差分析比較不同組間的相關性 , 以 P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 胎盤病理檢查結果 生理鹽水組母鼠胎盤病理檢測未見明顯炎癥反應 , LPS組母鼠胎盤內可見大量中性粒細胞浸潤、血管充血、水腫。

2. 2 免疫組化的檢測結果 GAP-43、IL-21的檢測按免疫組織化學試劑盒步驟進行 , 利用自動圖像分析系統對染色結果進行定量分析。各組各取 6張組織切片 , 鏡下隨機選取 6個位點測量陽性免疫反應產物面積 , 取平均值 , 結果表1。

表1 不同組間的 GAP-43和 IL-21表達

本研究結果顯示 , IL-21 在模型組腦室旁白質中含量最高 , 對照組含量最低 , 兩組間相比有極顯著差異 (P＜0.01)；與模型組相比 ：參麥組、神經節苷脂組 IL-21 含量明顯下降 ,差異有統計學意義 (P＜0.05), 聯合組 IL-21 含量明顯下降 , 差異有統計學意義 (P＜0.01)；與聯合組相比 , 參麥組和神經節苷脂組的 IL-21 含量偏高 (P＜0.05)；參麥組與神經節苷脂組比較兩組間差異無統計學意義 (P＞0.05)。GAP-43 在對照組腦室旁白質中陽性細胞數目屬最高 , 與對照組相比 , 模型組中 GAP-43 陽性細胞數明顯偏低 (P＜0.01), 聯合組差異無統計學意義 (P＜0.05), 參麥組和神經節苷脂組較空白組偏低 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)；與模型組相比 , 聯合組中 GAP-43陽性細胞數明顯增多 , 差異有統計學意義 (P＜0.01), 參麥組和神經節苷脂組較模型組 GAP-43 陽性細胞數增多 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)；與聯合組相比 , 參麥組和神經節苷脂組GAP-43 陽性細胞數偏低 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)；參麥組和神經節苷脂組間相比差異無統計學意義 (P＞0.05)。

3 討論

近年來 , 由于產科技術、圍產醫學、新生兒醫學的發展 ,新生兒死亡率、死胎發生率均有明顯下降 , 但腦癱發病率并無減少趨勢 , 重癥腦癱的比例有增多趨勢 , 且早產成為腦癱的主要病因之一。尋找可以促進損傷的腦神經反應性再生、結構重建的藥物 , 從而降低腦癱的發生率、減輕腦癱兒的殘障程度 , 是基礎研究的方向。

參麥注射液源于古醫方生脈散 , 由人參、麥冬等制備 ,可改善心、肝、腦等主要臟器的供血 , 能提高機體耐缺氧能力、改善微循環 ,對缺血性損害有保護性作用 , 目前臨床上多用于缺血性心、腦血管疾病的治療。但針對參麥治療早產兒腦損傷的作用機制研究較少。神經節苷脂針具有保護腦細胞膜 ,在腦細胞的生長、分化和再生過程中起關鍵作用 , 同時能促進腦細胞的損傷和修復 , 維持神經功能。既往［2］研究發現外源性的神經節苷脂能明顯縮短缺氧缺血性腦病的病程 , 降低缺氧缺血性腦病患兒的神經系統后遺癥發生率。

LPS 是革蘭陰性細菌感染后炎癥反應的主要成分 , 將其注入孕鼠腹腔 , 可造成新生仔鼠早產、仔鼠腦損傷模型。有研究表明［3］仔鼠腦組織內 IL-1β、腫瘤壞死因子 (TNF-a) mRNA 呈劑量依賴性增加 , IL-1β、腫瘤壞死因子 (TNF-a)通過一氧化氮合成酶出現協同炎癥反應而致腦損傷 , 而且內毒素的釋放增加腦缺血及出血的危險性。

GAP-43 主要分布在已定性并開始軸突生長的神經元細胞中 , 它與軸突延伸生長、突觸的形成有嚴格的同步性 , 因而將 GAP-43 視為研究神經生長發育和損傷修復的重要標記物之一［4］。神經節苷脂是神經細胞膜的組成成分 , 是臨床應用廣泛、作用明確的營養神經藥物 , 對腦神經的修復有作用。本研究結果表明 , 腦損傷早期積極應用神經營養藥物可使 GAP-43 表達增高 , 聯合組的 GAP-43 的表達明顯高于參麥組和神經節苷脂組 , 差異有統計學意義 , 說明參麥可以增強神經節苷脂的腦保護作用 , 促進神經的修復和再生。

IL-21 是一種新近發現的細胞因子 , 它可以調節 T 細胞的增值 , 促進 B 細胞、NK 細胞的增殖、分化并能提高 NK細胞殺傷活性 , 它在免疫應答中的依賴性可能根據免疫環境的變化而不同。以往研究表明［5］在免疫系統疾病 (克羅恩病、系統性紅斑狼瘡、艾滋病、原發性干燥綜合癥 )中 IL-21 對組織細胞有破壞性作用 , 同時它對腫瘤細胞有明顯的抑制作用。本研究結果表明 , IL-21 在腦損傷早期表達增多 , 可能參與炎癥反應的級聯放大作用 , 應用營養神經藥物可降低其表達 , 聯合用藥較單一用藥效果明顯 , 說明參麥注射液能夠通過降低 IL-21 的表達起到其腦保護作用。

本研究結果顯示 , 參麥對宮內感染致早產腦損傷仔鼠腦組織中 GAP-43 和 IL-21 表達有調節作用 , 它與神經節苷脂聯合應用可明顯降低腦組織中 IL-21 表達和使 GAP-43 表達升高 , 從而達到減輕腦損傷、促進神經生長、修復的作用。

綜上所述 , 腦癱的治療療程較長 , 無論是從經濟上還是從心理上都給患者家庭帶來沉重負擔 , 參麥注射液是一種中藥制劑 , 能夠從根本上提高機體耐缺氧能力、改善微循環 ,對缺血性損害有保護性作用 , 是腦癱患者的有效治療藥物 ,還可以大大降低腦癱治療的成本 , 具有很好的社會效益、可觀的經濟效益和特殊的學術價值。

參考文獻

［1］楊明 , 孫群 , 鄭志育 , 等 . 大劑量參麥注射液輔助治療新生兒充血性心力衰竭療效觀察 .中國現代醫學雜志 , 2006, 16(4): 610-611.

［2］曾林 . 神經節苷脂治療新生兒缺氧缺血性腦病療效觀察 .中國實用神經疾病雜志 , 2009, 12(3):84-85.

［3］Saliba E, Henrot A. Inflammatory mediators and neonatal brain damage. Biol Neonate, 2001, 79(324):224-227.

［4］Shen Y, Mani S, Donovan SL, et al. Grow associated pro-tein-43 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. J Neurosci, 2002, 22(21):239-241.

［5］王士杰 . 白細胞介素 21 的基礎與臨床研究進展 . 安徽醫藥 , 2009, 13(9):1016-1017.

2014-04-11］

471000 洛陽市婦女兒童醫療保健中心康復科 (王冬 )；河南中醫學院 (周慧茹 )