棕色棉DFR基因的克隆與生物信息學分析

肖向文 朱奇朗 劉海峰 王俊鐸 羅城 曾聞梁亞軍 龔兆龍 李曉波

（1. 中國科學院新疆理化技術研究所 干旱區植物資源化學重點實驗室，烏魯木齊 830011；2. 中國彩棉（集團）股份有限公司，烏魯木齊830016；3. 新疆農業科學院經濟作物研究所，烏魯木齊 830091）

天然彩色棉作為環境友好型的純天然綠色產品，其纖維具有自然色彩，可省略化學染色，既節省生產成本，降低環境污染，又可避免紡織品中的化學染料對人體健康可能存在的某些不良影響，是真正意義上的“綠色、生態、環保”天然纖維產品。彩棉紡織品被譽為“人類第二健康肌膚”、“天然的護膚品”，符合人們對衣著需求的發展趨勢和回歸自然的潮流，迎合了市場的需求，是21世紀國際綠色紡織品市場上最具發展潛力的產品之一，開發前景十分廣闊［1-3]。近幾年經過科研工作者的努力，選育出了一批產量、色澤、品質等綜合性狀較優的彩色棉新品種，在產量、抗性水平以及纖維品質等方面取得了一定進展，但彩色棉花一直存在著顏色單一、色譜狹窄、著色不均勻及色澤不穩定等問題，此外彩棉與白色棉相比，纖維品質仍然有一定差距，這些因素都制約了彩棉的進一步發展［4，5]。因此，提高彩棉的纖維品質及獲得穩定優良的色澤特性，對于彩棉產業的可持續發展具有重要意義。

彩棉色素物質是彩棉纖維中獨特的次生代謝產物，此前的相關研究表明，彩棉色素物質的合成同植物類黃酮合成途徑存在著密切關系［6]，但具體機制尚不清楚。因此，開展彩棉類黃酮合成途徑中關鍵基因的克隆、表達特性研究及轉基因功能分析，對于揭示彩棉色素合成及調控的分子機制以及利用基因工程技術進行彩棉纖維色彩及品質的分子改良有著重要的意義。

類黃酮（flavonoids）是植物次生代謝產物，類黃酮化合物中的花青素等物質是許多植物花、果實和種子色素的主要成分。迄今為止，在一些高等植物中，如擬南芥、玉米、矮牽牛等，有關類黃酮物質合成途徑的主要步驟已基本探明［7]，類黃酮途徑已成為研究植物次生代謝基因表達及調控的模式途徑，也是植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標。Xiao等［8]利用分子生物學方法，從棕色棉中分別克隆了類黃酮途徑中的5個關鍵酶基因查爾酮異構酶（CHI），黃烷酮羥基化酶（F3H），二氫黃酮-4-還原酶（DFR），花青素合成酶（ANS），花青素還原酶（ANR）；通過RT-PCR 的方法檢測在棉纖維不同發育時期這5個基因的表達情況，結果表明這幾個基因在棕色棉花中有較高的表達，而在白色和綠色棉花中表達量較低。此研究表明類黃酮途徑參與了彩色棉纖維中色素的合成。

為了研究DFR基因及類黃酮途徑在棕色棉纖維色素形成中的作用，本研究根據GenBank上登錄的棕色棉品種T586的DFR基因序列［5]設計引物，以新彩棉6號（XC-6）纖維的RNA以及DNA為模板克隆得到GhDFR基因的CDS全長編碼序列及帶有內含子的基因組序列。通過生物信息學的方法對GhDFR的氨基酸序列組成成分、理化性質、疏水性、二級結構、信號肽、亞細胞定位、結構域等方面進行較為全面的分析。此項研究為探究DFR基因在棕色棉色素形成過程中的可能的功能及作用機制奠定前期理論基礎，同時也為后期利用基因工程的技術對彩色棉的色彩進行遺傳改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選擇棕色棉品種新彩棉6號（XC-6）作為試驗材料，2012年4月種植于新疆天然彩色棉花研究所實驗基地，取開花后（DPA）16 d的纖維。所取新鮮材料迅速放入液氮中，-80℃保存備用。

1.1.2 菌種、質粒與試劑 大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；克隆載體pGEM-T Easy購自Promega；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購自天根公司；反轉錄試劑盒、DNA分子量Marker、ExTaqDNA聚合酶等購自TaKaRa。引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第一鏈合成 基因組DNA的提取采用CTAB法［9]，總RNA提取方法參照熱硼酸/蛋白酶K法［10-12]，總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，質量完好的RNA置-80℃保存備用。DNaseⅠ消化殘留的DNA后，參照TaKaRa公司提供的反轉錄試劑盒說明書以Oligo（dT）18為引物，使用M-MLV、37℃ 溫浴2 h，進行RT-PCR擴增，獲得cDNA第一條鏈。

1.2.2GhDFR基因的克隆與測序 根據GenBank登錄的序列EF187441，利用Primer 5.0進行引物設計，FP（Forward Primer）：5'-GGTCTTTCTTTATGCCAAC-TG-3'，RP（Reverse Primer）：5'-GACATGGGTAGGCACTCAATT-3'。PCR的擴增體系為20 μL，包括10×PCR Buffer 2 μL，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，模板cDNA（或基因組DNA）約50 ng，上下游引物各0.2 μmol/L，1 U Ex Taq DNA聚合酶（寶生物）。擴增程序：95℃ 預變性3 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35 個循環；72℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用天根公司的膠回收試劑盒回收DNA，連入Promega 公司pGEM-T Easy載體，轉化DH5α感受態細胞，將鑒定正確的陽性克隆質粒送上海生工公司測序。

1.2.3 引物的設計與生物信息學軟件 應用ExPASy工具包（http：//expasy.org/tools/）中的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析GhDFR氨基酸序列的組成和理化性質。利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質的信號肽。ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在線預測DFR蛋白的親水性/ 疏水性。應用PSORTII Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位。SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html）預測二級結構元件。序列相似性搜索用NCBI數據庫中的Blast完成（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。DFR核苷酸和氨基酸序列的同源性多重比對用DNAMAN完成。Pfam 27.0（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和NCBI的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）在線預測DFR蛋白的功能結構域。利用Clustal X軟件（http：//bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/）對基因組序列進行相似性比較，MEGA軟件（http：//www.megasoftware.net/）進行聚類分析。

2 結果

2.1 GhDFR基因的克隆與測序

核苷酸序列的測定結果如圖1，圖2，所克隆獲得的GhDFR基因組序列為1 620 bp，CDS序列的長度為1 068 bp，編碼355個氨基酸。序列結果已經提交GenBank，登錄號為：KF749429。根據核苷酸序列測定結果，利用生物信息學與比較基因組學的方法，推測出該基因基因組序列有5個內含子和6個外顯子，5個內含子以GT開始并以AG結尾的序列，而且3'端富含嘧啶核苷酸，基本符合內含子的類型。新彩棉6號中克隆的GhDFR基因CDS編碼區與克隆自彩棉品種T586的GhDFR基因EF187441的CDS編碼序列完全相同，與GenBank中已經登錄的FJ713480序列相比，其編碼區在5'端多出15個氨基酸編碼序列。內含子可能是提高基因表達的一種原因，通過分析基因內部內含子的組成，對理解基因的表達調控機制具有非常重要的意義。內含子還可以作為來研究物種進化的分子標記。

2.2 GhDFR編碼產物與其他植物GhDFR同源性比較

利用DNAMAN軟件將得到的GhDFR基因所編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的其他物種DFR的氨基酸序列完全比對，結果如圖3，發現該基因與圓葉葡萄VrDFR、毛果楊PtrDFR、葡萄VvDFR、天竺葵PzDFR、槿麻TcDFR、芍藥PlDFR、甜櫻桃PaDFR的氨基酸同源性較高，分別為80.8%、80.2%、79.6%、80.6%、79.0%、79.3%、76.9%，與擬南芥DFR同源性為72.7%。在GhDFR 蛋白質序列N端存在21個氨基酸殘基的 NADP（H）結合位點“VTGGSGFIGSWLIKLLLERGY”，該序列在不同植物中具有一定的保守性，另外還存在一個由26個氨基酸構成的底物特異性結合保守區域“TIDVAEQQKPCYDETCWSDLEFIQAK”，決定其底物的特異性［13，14]。NCBI的BLAST比對結果表明，DFR 蛋白屬于NADB-Rossmann超基因家族（NADBRossmann super-family）。

2.3 GhDFR氨基酸序列的理化性質

ProtParam分析得出：GhDFR蛋白的理論分子量為39.65 kD，等電點（pI）為5.67，其中Lys最多，有32個，占9.0%。其次為Leu，有29個，占8.2%。而Tyr較少只有7個，占2.0%。最少的是Trp僅有5個，占1.4%。其中帶負電荷的氨基酸有48個，帶正電荷的氨基酸有40個。不穩定指數為35.88，是一個相對穩定的蛋白。脂肪族氨基酸指數較高達到了85.15，這是因為GhDFR基因的蛋白含有較多的Leu。總的平均親水值Grand average of hydropathicity（GRAVY）為-0.168，是親水性蛋白。

圖1 GhDFR基因的全長序列及推斷的氨基酸序列

圖2 GhDFR內含子及外顯子分析

2.4 GhDFR的親水性/疏水性、亞細胞定位

蛋白質親水性/ 疏水性的預測是蛋白質二級結構預測以及功能域劃分的重要的過程。ProtScale的分析結果（圖4）表明GhDFR蛋白的親水性/ 疏水性的最大值為208位的脯氨酸2.378，最小值為265位的丙氨酸-2.478，親水/ 疏水趨勢圖形也基本一致，結果如圖4所示。總體而言，與前面所有氨基酸序列理化性質預測的結果一致，GhDFR蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 GhDFR與其他物種DFR基因編碼的氨基酸序列的多重比對

SignalP的分析結果（圖5）表明GhDFR蛋白不具有信號肽，說明GhDFR蛋白不是一個分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction 對GhDFR蛋白亞細胞定位，結果表明，GhDFR定位于細胞質的可能性最高，為43.5%；其次為線粒體的26.1%，細胞核8.7%，內質網8.7%，最低為分泌囊泡、高爾基體和過氧化物酶體，可能性均為4.3%。

2.5 GhDFR蛋白的二級結構和功能結構域的預測

SOPMA對GhDFR進行二級結構的預測結果顯示（圖6），共有α-螺旋（Alpha helix）133處，占二級結構的37.46 %，延伸鏈（Extended strand）50處，占總二級結構的14.08%，β-轉角（Beta turn）26處，占二級結構的7.32%，無規卷曲（Random coil）146處，占二級結構的41.13%。該蛋白中α-螺旋和無規則卷曲為該蛋白二級結構中的主要結構元件，分散于整個蛋白質中。

圖4 GhDFR蛋白的親水性/疏水性分析

圖5 GhDFR蛋白的信號肽預測分析

蛋白質結構域是蛋白質執行功能的結構基礎。Pfam27.0預測GhDFR蛋白的結構域的結果（圖7）表明，GhDFR蛋白只有一個明顯的結構域，即NAD dependent epimerase/dehydratase family，與NCBI的CDD在線預測結果一樣，都證實了GhDFR 屬于NADB-Rossmann superfamily。

2.6 GhDFR蛋白系統進化分析

應用Clustalx1.83軟件將編碼的氨基酸序列及從GenBank獲取的其他植物的DFR基因推導的氨基酸序列進行比對分析，然后利用 MEGA5.2軟件按鄰接法構建系統進化樹，結果如圖8所示，途中所示數字為相對遺傳距離。GhDFR與天竺葵PzDFR蛋白以及芍藥PlDFR的親緣關系最近，可以聚為一類，與擬南芥AtDFR親緣關系較遠。

3 討論

圖6 GhDFR蛋白的二級結構預測圖

圖7 GhDFR 蛋白的結構域分析

圖8 GhDFR與其他高等植物 DFR蛋白的進化樹分析

花色苷合成的類黃酮途徑是研究的最為清楚的植物次生代謝途徑之一［7]，類黃酮類化合物是植物花青素的主要成分，是花卉、果實、種皮重要的成色物質。DFR即二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase）屬于細胞色素P450家族，是類黃酮/花青素生物合成途徑的一個關鍵酶，在類黃酮途徑中，DFR催化二氫黃酮醇，如二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），在C4位發生立體特異的還原反應，分別生成無色天竺葵素、無色矢車菊素和無色飛燕草素（翠雀素），這些產物都是合成有色的花色苷類物質的前體物質［7，13]。從O’Reilly第一次克隆得到DFR基因開始，利用同源克隆的方法分別在矮牽牛（Petunia hybrida）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、金魚草（Antirrhinum majus）、番茄（Lycopersicon esculentum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria ananassa）、玉米（Zea mays）等物種中都已經克隆出來，其分子特征和調控機制已在很多植物中得到深入研究，研究發現來自不同物種的DFR有非常高的同源性，但是不同植物的DFR結合底物的特異性有所不同。在矮牽牛中，DFR優先轉化DHM生成無色翠雀素，其次是DHQ，不能轉化DHK，因此矮牽牛中缺乏天竺葵色素，將玉米的DFR基因A1轉化矮牽牛，A1能夠催化DHK生成無色天竺葵素，進而在花青素合成酶（ANS）的作用下生成桔紅色的天竺葵素，矮牽牛花色由淡紅色變為桔紅色［14]。關于底物選擇特異性的分子機理，Beld等［15]根據對矮牽牛DFR的研究提出了一個由26個氨基酸組成的底物特異性結合區域，該區域的氨基酸序列決定DFR對底物的特異性結合。隨后，Johnson等［16]利用DFR單氨基酸突變體證明改變底物特異性結合區域的某些氨基酸能夠改變矮牽牛DFR的底物特異性，而有些位置的氨基酸具有高度保守性，并確定了與底物特異性直接相關的幾個氨基酸殘基，如133位、134位、142位和145位，其中第134位氨基酸直接決定底物特異性，矮牽牛DFR第134位是Asp，其最佳底物為DHM，對DHQ的還原效率很低，不能以DHK為底物生成天竺葵素，其他134位是Asn的植物都能以DHK為底物。將矮牽牛134位的Asp替換為Leu，則DFR從只以DHQ和DHM為底物變為優先轉化DHK，而不能有效轉化DHM。根據DFR蛋白該相應位置氨基酸殘基不同，發現植物DFR分為幾種類型，即Asn型、Asp型及非Asn/Asp型，在植物中Asn型DFR分布廣泛，單子葉植物都是Asn型DFR，而Asp型DFR只分布在矮牽牛等部分雙子葉植物中。此外，只有少數植物含有非Asn/Asp型。根據蛋白比對結果，本研究克隆得到的棉花GhDFR屬于第二種類型（即Asp類型），推測其不能以DHK為底物生成無色天竺葵素，但目前還沒有關于棉花中花青素組成成分的報道。

內含子是在轉錄后的加工中，從最初的轉錄產物除去的內部的核苷酸序列。內含子可能含有“舊碼”，就是在進化過程中喪失功能的基因部分。正因為內含子對翻譯產物的結構無意義，它比外顯子累積有更多的突變。但越來越多的試驗結果表明，內含子在基因的表達與調控中起著非常大的作用。擬南芥、矮牽牛和金魚草等雙子葉植物的DFR基因都由6個外顯子和5個內含子組成，而且它們的內含子位置都大致相同［17]。本研究從棉花中得到的GhDFR基因的DNA序列也是由6個外顯子和5個內含子組成，說明該基因在進化上具有一定的保守性，這類基因可能具有較為重要的功能。

目前關于DFR在類黃酮/花青素合成途徑中的作用及相關轉錄調控方面已有較多研究，影響DFR基因表達的因素可分為兩類：內部因素（各種轉錄因子的調控，如MYB、bHLH和WD40蛋白等）和外界因素（如光照、溫度等環境誘導因素），但目前對彩色棉類黃酮/花青素相關方面的研究還很少。本研究從彩棉DFR基因入手，利用生物信息學手段對棉花GhDFR基因的相關蛋白性質、結構及系統進化關系等進行了初步研究，為將來研究彩色棉類黃酮/花青素生物合成以及利用基因工程技術進行彩棉種質資源的創新奠定了重要基礎。

4 結論

從棕色棉中克隆到GhDFR基因的全長編碼序列及內含子序列，該基因含有6個外顯子，5個內含子，其編碼的氨基酸序列包含具有高度保守性的NADP（H）的結合位點以及底物特異性結合位點，系統進化分析結果表明其與天竺葵、芍藥的DFR親緣關系較近。

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