甲氨蝶呤/層狀雙金屬氫氧化物的性能調控及細胞生物實驗研究

霍曉磊 柳素青 李淑萍

(江蘇省生物醫藥功能材料協同創新中心，江蘇省生物功能材料重點實驗室，南京師范大學化學與材料科學學院，南京210097)

0 引 言

層狀雙金屬氫氧化物(Layered Double Hydroxide，LDH)，也稱類水滑石 (hydrotalcite like compounds)，是一類由帶正電荷的金屬氫氧化物層和層間充斥的可交換陰離子所構成的層狀化合物，化學通式可表示為:[M2+1-xM3+x(OH)2]x+[An-]x/n·mH2O,其中 M2+表示+2價金屬離子，M3+表示+3價金屬離子，An-表示層間陰離子，x為每摩爾LDH中M3+的摩爾數；m是每摩爾LDH中結晶水的摩爾數[1-4]。由于LDH具有層間陰離子的可交換性和層間空間的可調性，因此，可以將某些無機、有機、配合物陰離子以及一些生物藥物分子等插入其層間，且LDH獨特的層板結構，能夠有效地保護插入其中的分子或離子[5-8]。LDH為藥物載體不僅可以提高藥物的安全性、有效性，還可以提高藥物的穩定性和溶解度，控制藥物的釋放速率，因而具有廣泛的應用價值，是近年來新發展的一個非?；钴S的領域[9-12]。

甲氨蝶呤(Methotrexatum，簡稱MTX)是一類抗葉酸類抗腫瘤藥，主要通過對二氫葉酸還原酶的抑制而達到阻礙腫瘤細胞DNA的合成，從而抑制腫瘤細胞的生長與繁殖，主要適用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎、頭頸部腫瘤、骨腫瘤、白血病腦膜脊髓浸潤、肺癌、生殖系統腫瘤、肝癌、頑固性普通牛皮癬、系統性紅斑狼瘡、皮肌炎等自身免疫病[13]。MTX價格便宜、藥效顯著，但它具有不良反應嚴重、體內半衰期短、組織分布廣泛、器官靶向性差等缺點[14-15]。因此，減少MTX的不良反應，提高其生物利用度，成為醫藥界和科學界的研究熱點。研究表明，甲氨蝶呤(MTX)嵌入LDH層間后，因靜電相互作用而使其穩定性大為增加；相同藥物濃度下，MTX/LDH復合物的藥效約為MTX本身的5 000倍[16]。Choy等[16-17]以LDH為載體，采用共沉淀法成功合成了MTX/LDH納米復合物，并分別將MTX和MTX/LDH作用于人類骨肉瘤細胞(SaOS-2)中，研究發現MTX/LDH抑制腫瘤細胞生長的效率遠遠高于純MTX的，且體內釋放半衰期延長，器官靶向性增強。

制備MTX/LDH納米復合物最常用的方法是共沉淀法。共沉淀法具有操作簡單、條件容易控制等優點，但同時存在著粒徑分布難以控制、易團聚、單分散性差等缺點[18]，對實際應用造成了很大的影響。我們課題組采用了改進的共沉淀法[19-20]成功制備出了單分散性好，粒徑分布均一的MTX/LDH復合物。從應用層面上看，一種新型的載藥系統無論其具有多么優良的理化及藥劑學特性，最終均應以生物效應來評價其實際應用。本文采用了改進的共沉淀法，并通過控制水熱處理時間的方式來調控MTX/LDH納米復合物的性能，重點研究了MTX/LDH納米復合物對肺癌細胞A549的抑制作用。我們的研究結果發現MTX/LDH納米復合物的物化性能與抗癌效果之間存在著某種密切的關系，我們首次利用分散系數ε對此進行了量化，這為MTX/LDH納米復合物的結構-藥效相關性的研究打下了堅實的基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：用D/max-2500PC型XRD儀測定樣品的相結構，靶壓200 kV，靶流 100 mA，Cu Kα射線源為光源，λ=0.154 06 nm，用石墨單色器濾波；H-7650-HITACHI型TEM儀觀察粒子的大小和形貌，工作電壓為200 KV；Bruker Tensor 27型FT-IR光譜儀，樣品與KBr質量比為1∶100；Cary50型紫外可見分光光度計，單波長測量，波長為306 nm，5%CO2培養箱，超凈工作臺；TCL-16C離心機。

試劑：Mg(NO3)2·6H2O(固含量不少于 99%)，分析純，廣東汕頭市西隴化工廠有限公司；Al(NO3)3·9H2O(固含量不少于99%)，分析純，上海新寶精細化工廠；NaOH(固含量不少于96%)，分析純，天津市化學試劑三廠；甲氨蝶呤(MTX)，浙江省湖州展望藥業有限公司；乙醇(含量不少于 99.7%)，分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；二甲亞砜(DMSO)，分析純，上海生物工程有限公司；小牛血清(BB001)，上海生物工程有限公司；DMEM(編號PB0680)培養基，上海生物工程有限公司；MTT(Sigma編號T0793)，上海生物工程有限公司；胰蛋白酶(PB0680)，上海生物工程有限公司；酶標儀(Thermo MK4,USA)；實驗用水均為去離子水。

1.2 共沉淀法合成MTX/LDH

稱取 0.769 2 g Mg(NO3)2·6H2O、0.562 7 g Al(NO3)3·9H2O溶于乙醇與水體積比為1∶3的混合溶液中，并轉移至三頸燒瓶中，在恒定溫度為60℃的條件下磁力攪拌，并通以氮氣。將0.340 8 g的MTX溶于20 mL乙醇與2 mL 5%的氨水混合液中，迅速倒入三頸燒瓶中，用10%的氨水作為沉淀劑，控制沉淀劑以0.1 mL·s-1的滴加速率滴加到上述混合溶液中，調節溶液的pH值至9.5，恒溫繼續攪拌，保溫1小時。待反應結束后，在4 000 r·min-1轉速下將所得產物用無水乙醇離心洗滌2遍，并用去離子水離心洗滌3遍，每次離心時間為3 min，以清除吸附在表面的MTX。將沉淀分散于25 mL水中，轉移至50 mL反應釜(內襯為聚四氟乙烯)內，80℃條件下水熱處理6～48 h。水熱處理完畢之后，干燥得到產物。

1.3 緩釋性能研究

根據測出的載藥量計算出做緩釋性能實驗所需的MTX/LDH的量，將稱量好的MTX/LDH納米復合物置于pH值為7.4(500 mL)的磷酸緩沖液(按照中國藥典2005年版第二部附錄XIVE方法配置)中，在(37±0.5)℃下恒溫攪拌，一定的時間間隔內，取3 mL溶液10 000 r·min-1下離心30 s后取其上清液，用紫外-可見分光光度計在306 nm處測其吸光度，并根據標準曲線 A=0.051 85c+0.000 62(r=0.999 99，n=7)計算 MTX 的累積釋放量。

1.4 MTT細胞生物實驗

人肺癌A549細胞接種于100 mL的培養中，培養基為含有10%小牛血清的DMEM，置于37℃，5%CO2恒溫培養箱內培養箱孵育，用顯微鏡觀測待細胞長滿培養瓶的80%～90%，用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。用10%DMEM將懸浮的細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，正常培養24 h后吸走廢液，加入不同濃度的 MTX和MTX/LDH，如 20、40、60、80、120 μg·mL-1(用 DMEM 稀釋)，每組設 6 孔重復，對照組加 100 μL DMEM(無血清)，分別培養 24 h后棄除96孔板中的殘藥和DMEM，每孔加入新鮮DMEM(無血清)90 μL，10 μL MTT(5 mg·mL-1，pH=7.4的 PBS配制)，繼續培養4 h后，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩5 min，用酶標儀檢測。

2 結果與討論

2.1 XRD分析

圖1為不同水熱處理時間下制備的MTX/LDH的XRD圖，考察了100℃下水熱處理時間分別為6、12、24、36 和 48 h 下得到的 MTX/LDH 納米復合物的性能。從圖中可以看出水熱處理時間較短(6 h)時，所得產物的XRD特征衍射峰峰值較低。12～48 h下制備的MTX/LDH納米復合物都具有尖銳的(003)、(006)面特征衍射峰，基線低且平穩，衍射峰峰型窄且尖，表明制備的MTX/LDH納米復合物晶相單一，晶體結構一致，晶面生長的有序程度高，結晶度好。分析XRD圖可知，水熱處理6 h后得到的樣品，其衍射峰強度最低，結晶度最差，水熱處理12 h后的樣品衍射峰強度最高，峰形最好，這說明水熱處理12 h后得到的MTX/LDH納米復合物的晶型發育最完整。

圖1 不同水熱處理時間下制得的MTX/LDH納米復合物的XRD圖Fig.1 XRD patterns of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

表1 不同水熱處理時間下制備的MTX/LDH的晶體結構數據Table 1 Characteristic data of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

圖2 不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物的排列方式示意圖(左)6～36 h;(右)48 hFig.2 Scheme of the arrangement of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time(left)6～36 h;(right)48 h

表1為不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物的特征數據及平均粒徑。根據布拉格公式可以計算出MTX/LDH的層間距，由于LDH層板厚度為0.48 nm[21]，可以得到樣品的通道高度隨著水熱處理時間的延長分別為 1.738 3、1.647 5、1.674 5、1.640 7 和 2.122 3 nm。甲氨蝶呤分子的長度為2.12 nm[22]，據此我們模擬了不同水熱處理時間下制得的MTX/LDH納米復合物空間排列示意圖，如圖2所示：隨著水熱處理時間的增加，MTX在LDH層間從單分子傾斜排列變化到垂直單分子排列。平均粒徑是通過測定多張(＞50，保證200個粒子以上)TEM圖中粒子的粒徑得到的，也列于表1。從中可以看出：不同的處理時間對產物的層間距有非常大的影響，當水熱處理時間較短時(6～36 h)，MTX以單層傾斜的方式排列，當時間增加到48 h時，層間距急劇增大，MTX以單層垂直的方式排列。

2.2 FT-IR分析

圖3顯示了不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物的FT-IR光譜圖。從圖3可以看出，3 400 cm-1處的寬峰對應于LDH層板上和層間水分子的OH伸縮峰[23]。1 614 cm-1和1 456 cm-1處的吸收峰對應于MTX中芳香環的C=C伸縮振動峰[21]，這些峰的出現表明MTX已經成功插層到LDH層間。1 207 cm-1處的吸收峰為MTX的C-N鍵。在低頻振動區間，出現的吸收峰對應著點陣振動模式(Al-O，Mg-O，Al-O-Mg 等)。

圖3 不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

2.3 TEM圖分析

圖4 不同水熱處理時間下制備的MTX/LDH納米復合物的TEM圖和粒徑分布圖Fig.4 TEM images and distribution of particle size of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

圖4為不同水熱處理時間下制備的MTX/LDH納米復合物的形貌及相應的粒徑分布圖。從TEM圖中可以觀察到不同水熱處理時間下制備的MTX/LDH納米復合物基本呈圓形，水熱處理時間的不同導致了粒子粒徑發生變化。隨著水熱處理時間的延長，粒子粒徑逐漸變大。但水熱處理時間過短或過長則會導致單分散性降低、形貌不規則程度的加劇。不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物的平均粒徑列于表1中。從表中可以看出，隨著水熱處理時間的延長，MTX/LDH粒子的平均粒徑逐漸增大，增加速率先快后慢。48 h時粒徑最大。從TEM圖中可看出處理時間為6 h或超過24 h后，粒子單分散性變差，粒徑均勻度變差。12 h和24 h得到的粒子單分散性好且粒子形狀均勻。綜上所述，從粒子形貌、單分散性、結晶度等角度來分析，12 h樣品的物化性能最為優良。

2.4 緩釋性能研究

首先對不同水熱處理時間得到的5種樣品進行了載藥量的測定，6～48 h樣品的載藥量分別為42.6%、52.3%、47.6%、52.7%和 51.5%，據此可以看出，LDH是一類載藥能力很強的載體，復合物的平均粒徑與其載藥量之間并無直接關系。圖5為這5種樣品的緩釋曲線圖。從圖中可以看出，5種樣品均呈現出良好的緩釋性能，釋放速率先快后慢，前150 min是一個較為快速的釋放過程，而以后的150～500 min釋放速率緩慢，整個過程中未出現突釋現象。這種釋放模式非常適合臨床應用，開始時的快速釋放能滿足最初的治療目的，而后來的控釋-緩釋模式則能保持體內藥物濃度的穩定，從而達到最佳的治療。其中48 h樣品釋放速率最慢，從表1可以看出，48 h樣品與36 h樣品粒徑相近，分別為216.34 nm 和 210.00 nm，而 MTX 在 LDH 層間排列方式有較大差異，36 h樣品中MTX在LDH層間的傾斜角度為50.71，48 h樣品MTX在LDH層間以單層垂直方式排列。從圖5中可以看出36 h樣品的釋放速率遠遠大于48 h樣品的釋放速率：100 min時，36 h的釋放達到63%，而48 h樣品僅為54%，500 min時，36 h最終釋放率為75%，48 h樣品僅達到66%。這說明了層間排列方式的不同導致了其釋放速率不同，層間傾斜角度越大，釋放速率越慢，與段雪等人的結論一致[24]，段雪的研究表明層間陰離子在層間的不同排布方式會極大地影響其釋放速率。

圖5 不同水熱處理時間制得的MTX/LDH納米復合物的釋放曲線圖Fig.5 Release profiles of MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

2.5 動力學模擬

一般來講，生物藥物/LDH納米復合物的釋藥機制主要有兩種：離子交換機理和LDH片層的溶蝕[25]。為了探索MTX/LDH納米復合物的釋藥機理，通常采用以下4種常用的數學模型對MTX/LDH的釋放過程進行擬合[26-27]。

(1)一級方程：ln(1-Mt/M∞)=-kt，多用于描述釋放基質溶解所引發的藥物釋放行為和離子交換過程；

(2)Higuchi方程：Mt/M∞=kt0.5，它是以 Fickian 擴散定律為基礎提出的動力學方程，適用于遵循擴散控釋機理的釋藥過程；

(3)Bhaskar方程：ln(1-Mt/M∞)=-kt0.65，用于描述不規則擴散或者粒內擴散機理；

(4)Ritger-Peppas方程：Mt/M∞=ktn，其中 n 為表征釋放機制的特征參數。當 0.45＜n＜0.89 時，藥物的釋放機制為non-Fickian擴散，即擴散與溶蝕并存；當 n＜0.45 時，為 Fickian 擴散；當 n＞0.89 時，為骨架溶蝕機制；

以上4個方程中，其中Mt為t時間的累積釋放量，M∞為∞時累積釋放量，Mt/M∞為t時累積釋放率，k為釋放常數。

采用這4種常用的數學模型對MTX/LDH的體外釋放數據進行動力學擬合，其結果示于圖6，擬合數據列于表2。由擬合結果可知，采用First-order方程擬合得到的擬合因子R均較小，從圖6中可看出其擬合數據點離散嚴重，說明MTX/LDH納米復合物的釋藥機制不符合First-order方程。相對于Firstorder方程，采用Bhaskar方程擬合得到的擬合因子相對較高(僅 24 h 樣品的 R＜0.95)，初步判斷 MTX/LDH納米復合物在pH=7.4的磷酸緩沖液中釋放出MTX分子的機制屬于擴散機制。進一步采用Ritger-Peppas方程，從擬合結果 R＞0.96 及 n＜0.45 可判定，MTX/LDH納米復合物的釋藥機制屬于離子交換機理，且釋放過程為擴散控制過程。最后采用parabolic-diffusion模型擬合得到了最高的擬合因子(R＞0.98)，說明MTX/LDH納米復合物的釋藥機制為粒內擴散或表面擴散所引起的擴散控制過程；也就是說，MTX/LDH納米復合物在釋放過程中主要是介質中的HPO42-、H2PO4-將LDH層間的MTX陰離子置換出來，使得層間的MTX陰離子進入到緩釋介質中。綜上，MTX/LDH在模擬體液中釋放出MTX的機理為基于離子交換的多相擴散過程，parabolicdiffusion模型能很好地闡述其釋放機理。

圖6 不同水熱處理時間下得到的MTX/LDH納米復合物釋放過程的動力學擬合直線Fig.6 Plots of different kinetic models for the release of MTX from the MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

表2 不同水熱處理時間下制得的MTX/LDH納米復合物釋放過程的動力學擬合數據Table 2 Fitting parameters of different kinetic models for the release of MTX from the MTX/LDH nanohybrids obtained at different hydrothermal treatment time

2.6 細胞生物實驗探索

MTX/LDH納米復合物對某些癌細胞有非常明顯的抑制效果，關于MTX/LDH納米復合物抗癌-抑癌作用的研究，韓國科學家Choy等作出了大量的工作，他的研究結果表明，LDH母體即使在很高的濃度下對人體也是無害的，MTX/LDH納米復合物的抗癌效果隨著作用時間的延長而增加，隨著復合物濃度的增加而增強；粒徑在100～300 nm之間的復合物對癌細胞的攝入和治療效果最佳[16-17,28]。但是影響復合物抗癌-抑癌效果的關鍵因素目前還未有相關的報道，我們試圖進行這方面的探索性研究。因而我們引入了一個新的參數：分散系數ε，ε與粒子的粒徑和單分散性有關。ε值的提出鑒于這樣的出發點：合成的復合物粒子粒徑越均勻，它對癌細胞的抑制作用越均勻與穩定；粒徑越小，因表面效應而產生的抑癌效果越明顯。其定義式如下：

其中D是平均粒徑，D為所測粒子的半徑，n為所測粒子的數目,δ為標準偏差，ε值越小表明該體系的分散性越好。不同水熱處理時間下得到復合物的ε值列于表1，同時復合物對肺癌細胞A549的抑制效果與ε的關系見圖7。從圖7可以看出，復合物的抗癌效果與ε值密切相關，ε值越小，復合物的抑癌-抗癌效果越明顯；而復合物的平均粒徑與其抗癌效果之間并無直接關系。從我們的研究結果還可以看出抗癌效果最好的12 h樣品，其粒子形貌最規則、單分散性最好、晶型發育最完整、載藥量也很高。這說明MTX/LDH納米復合物的物化性能與抗癌效果之間存在著某種密切的關系。而這種關系我們首次利用分散系數ε進行了量化處理。我們試圖通過這個參數來量化構建MTX/LDH納米復合物的結構-藥效相關性，當然其科學性和準確性還需進一步的研究確認。

圖7 MTX/LDH納米復合物的抗癌效果與ε值的關系Fig.7 Comparison of Cell viability tests for MTX/LDH nanohybrids with different ε values

3 結 論

通過改變水熱處理時間來調控MTX/LDH納米復合物的粒徑以及單分散性，研究表明水熱處理時間的不同會導致復合物的粒徑、單分散性以及結晶度的不同，據此在宏觀上可以通過控制水熱處理時間來制備不同性質的MTX/LDH納米復合物。將得到的5種MTX/LDH納米復合物作用于肺癌細胞A549進行細胞生物實驗，對實驗結果首次采用分散系數ε構建MTX/LDH納米復合物的結構-藥效相關性。研究表明，ε值越小，該復合物體系的分散性越好，相應地對肺癌細胞A549的抑制效果越明顯。

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