一種基于BODIPY的Zn2+熒光探針：ICT增強效應

邱 琳 季一凡 朱成成 陳韻聰 何衛江＊, 郭子建＊,

(1南京大學化學化工學院配位化學國家重點實驗室，南京 210093)

(2常州大學制藥與生命科學學院，常州 213164)

作為人體內最重要的過渡金屬離子之一，鋅離子不僅參與了神經信號傳遞、基因轉錄、信號轉導和免疫反應等生理過程[1-2]而且還與許多疾病如老年癡呆癥、糖尿病、前列腺癌等的病理過程相關[3-5]。利用熒光探針檢測鋅離子在生命體系中的實時分布信息對理解這些相關過程具有重要的意義，因此發展鋅離子熒光探針是目前研究的熱點之一[6]。除了紫外激發的經典探針TSQ系列外[7],目前報道較多的Zn2+探針主要有ZP系列[8]和ZnAF[9]系列，也是目前最為成功的鋅離子探針。這兩類探針均基于熒光素而設計，一般激發在490 nm左右，發射在520 nm左右。顯然發展具有更長激發和發射波長的鋅離子熒光不僅有利于進行各類細胞共染造影，而且有利于降低自發熒光、光毒性及光漂白等短波長造影中的不足。

用于探針設計的典型熒光團有熒光素[9-11]、萘酰亞胺[12-14]、香豆素[15-16]、川菁[17-18]、羅丹明[19-21]以及氟硼吡咯[22-23](4-difluoro-4-borata-3a-azonia-4a-aza-s-indacene，BODIPY)等。其中BODIPY類染料分子有較高的剛性和芳性，因此該類染料具有良好的光穩定性、較高的摩爾消光系數和熒光量子產率。由于這類分子還具有發光性能環境依賴性小、吸收及發射帶較窄等優點，因而基于BODIPY的探針設計報道較多[24-25]，以BODIPY來構筑鋅離子熒光探針有利于降低光漂白延長造影時間，并為各類共染造影和不同激發光源配置的造影設備提供更多的選擇。然而常見 BODIPY探針 Stokes位移較小(＜20 nm)，易造成激發干擾。它們的激發波長一般在500 nm左右，與熒光素類探針的激發過于接近，共染時易發生相互影響。BODIPY通常發出綠色熒光，波長在510 nm左右的，較易受到自發熒光干擾。根據Rurack等人的報道，BODIPY類熒光團α-位進行推電子基取代苯乙烯修飾，不僅可明顯增強BODIPY分子內存在的ICT效應，而且能顯著提高BODIPY熒光團的吸收和發射波長、增加斯托克斯位移[26]。這些均有利于進一步降低造影中的自發熒光干擾、光毒性和激發干擾。據此我們設計了一個新的基于BODIPY的Zn2+熒光探針 BDP-m-BPA(圖 1)。在探針分子中meso-位引入了將對位氨基修飾為Zn2+螯合團bis(2-pyridylmethyl)amine(BPA)[27-28]的苯環。其中BPA基團的氨基將對BODIPY熒光團的熒光具有PET淬滅效應[28]。BPA與Zn2+配位將導致PET效應的阻斷并誘導探針分子的熒光增強，實現對Zn2+的增強響應。α-(4-羥基)苯乙烯的引入可擴展分子的共軛體系并促進ICT效應以提高探針的激發和發射波長并增大Stokes位移。

圖1 探針BDP-m-BPA的合成路線Fig.1 Synthesis of sensor BDP-m-BPA

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

合成中常用試劑和溶劑均為國內商業試劑，其中二氯甲烷經CaH2干燥后使用，甲苯經鈉/二苯甲酮回流干躁后使用，其余試劑未做純化。三氟乙酸(TFA)和 2，4-二甲基吡咯購自 Alfa公司。N，N，N′，N′-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)，Zn(NO3)2，三羥甲基氨基甲烷(Tris)和用于光譜及造影測試中的各類無機鹽均為來自Aldrich和Alfa的分析純試劑。光譜測試中所用溶劑如乙醇等為Aldrich光譜純試劑，水為經MILIPORE處理的超純水。電噴霧質譜用LCQ電噴霧質譜儀(Thermo Finnigan)測定，并用ISOPRO 3.0程序模擬其同位素分布模式。探針分子高分辨質譜用 Agilent 6540Q-TOF HPLC-MS測定。1H，13C NMR在Bruker DRX-500或Bruker DRX-600核磁儀上用標準脈沖序列測定 (298 K))。紫外光譜用PerkinElmer Lambda 35紫外可見光譜儀測定。熒光光譜在Horiba Scientifc Fluoromax-4發光光譜儀上測定。pH值用PHS3精密pH計記錄。

1.2 熒光配體BDP-m-BPA的合成

1.2.1 化合物 2 的合成

化合物1采用文獻報道的方法[29]。氮氣保護下將化合物 1(0.303 g，1 mmol) 和 2，4-二甲基吡咯(0.190 g，2 mmol)用 50 mL 無水二氯甲烷溶解，加入一滴TFA后室溫攪拌[30]。TLC跟蹤至化合物1反應完全。加入無水二氯甲烷溶解的DDQ(0.220 g，1 mmol)后繼續攪拌30 min。隨后加入2 mL無水三乙胺攪拌5 min，繼續加入2 mL BF3·Et2O攪拌1 h。將混合物用飽和食鹽水洗滌一次后以無水硫酸鈉干燥有機層，硅膠柱層析分離(200～300 目，VCH3OH∶VAcOEt=1∶10)得到橘色固體 102 mg，產率 20%。1H NMR(300 MHz，CDCl3) δ=1.47(s，6H)，2.56(s，6H)，4.91(s，4H)，5.97(s，2H)，6.82(d，J=8.5 Hz，2H)，7.02(d，J=8.5 Hz，2H)，7.23(m，J=12 Hz，2H)，7.27(d，J=8 Hz，2H)，7.67(t，J=15 Hz，2H)，8.63(d，J=4.5，2H)。

1.2.2 化合物 3 合成

氮氣保護下將化合物 2(0.240 g，0.46 mmol)，對羥基苯甲醛(0.060 g，0.50 mmol)，0.10 mL 哌啶，少量4A分子篩，一起置于5 mL無水甲苯中混合加熱至110℃并維持24 h[30]。冷卻至室溫后蒸干溶劑，殘余物經硅膠柱層析分離 (200～300 目，VAcOEt∶VMeOH=20∶1)得到深紫紅色固體60 mg,產率21%。1H NMR(500 MHz，CD3OD) δ=1.45(s，3H)，1.50(s，3 H)，2.50(s，3H)，4.95(s，4H)，6.02(s，1H)，6.69(s，1H)，6.83(d，J=10 Hz，2H)，6.87(d，J=10 Hz，2H)，7.03(d，J=8 Hz，2H)，7.31(m，J=35 Hz，3H)，7.37(d，J=8 Hz，2H)，7.44(m，J=25 Hz，3H)，7.79(t，J=15 Hz，2H)，8.55(d，J=5 Hz，2H)。

1.2.3 目標化合物BDP-m-BPA的合成

60 mg化合物3加入2 mL醋酸酐加熱至50℃，維持8 h后結束反應[31]。減壓蒸干溶劑，用二氯甲烷洗滌得到深藍色固體，產率90%。1H NMR(600 MHz，CDCl3) δ=1.37(s，3H)，1.41(s，3H)，2.58(s，3H)，3.99(s，3H)，4.90(s，4H)，5.99(s，1H)，6.59(s，1H)，6.73(d，J=12 Hz，2H)，7.20(m，J=42 Hz，3H)，7.26(d，J=12 Hz，2H)，7.46(m，J=42 Hz，5H)，7.67(t-d，J=24 Hz，6 Hz，2H)，8.19(d，J=12 Hz，2H)，8.67(d，J=6 Hz，2H)ppm。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ=14.44，14.64，14.80,29.71,55.37,56.49,112.87,115.59,117.87,120.99,121.90,126.46,128.76，129.38，130.26，130.71，130.90,132.49,136.99，138.73，140.18，141.17，142.40,148.11,148.36,154.45,154.20,157.40,166.53。HRMS(EI)(positive mode，m/z)：Calcd.668.300 3，Found 668.301 5 for[M+H]+。

1.3 BDP-m-BPA的熒光、吸收光譜及其Zn2+滴定測試

取BDP-m-BPA的乙醇儲備液加入到100 mL的容量瓶中并用Tris-HCl緩沖溶液 (20 mmol·L-1，pH=7.20) 和乙醇定容，配成濃度為 10 μmol·L-1的(VC2H5OH∶Vwater=1∶1)溶液進行吸收和熒光光譜測量。吸收光譜和熒光光譜滴定均通過向3 mL BDP-m-BPA溶液中分別加入等分體積的Zn(NO3)2水溶液(1.2 mmol·L-1)完成。每次加 3 μL，充分混勻后進行紫外和熒光測試。

1.4 BDP-m-BPA對不同金屬離子的熒光響應

探針對金屬離子選擇性熒光響應能力測試及Zn2+在其他金屬離子存在下的競爭性熒光響應實驗均在前述介質中進行。實驗中向3 mL探針(10 μmol·L-1)溶液中加入 15 μL 濃度為 12 mmol·L-1的金屬離子水溶液 (金屬離子總濃度為探針濃度的6倍)，充分混勻后進行測試。競爭響應研究中向3 mL探針 (10 μmol·L-1) 溶液中加入 15 μL 濃度為 12 mmol·L-1的Zn(NO3)2水溶液，充分混勻后記錄光譜。然后再向此溶液中加入15 μL濃度為12 mmol·L-1的其他金屬離子或6 μL濃度為1 mol·L-1的堿金屬或堿土金屬離子溶液，混勻后記錄光譜。

1.5 BDP-m-BPA的線性響應范圍及檢測限測定

測試在含 1 μmol·L-1BDP-m-BPA 的 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)中進行。向3 mL探針溶液中分別加入Zn2+水溶液(0.12 mmol·L-1)，每次加 3.0 μL，充分混勻后進行熒光測試。檢測限測試先掃描背景11遍，獲得標準偏差σ。檢測限利用3σ/S求出，其中S為線性響應范圍內的斜率。

1.6 BDP-m-BPA量子產率的測定

配體溶液為 1 μmol·L-1的 Tris-HCl溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)。羅丹明 B 作為為基準物(Φf=0.97，C2H5OH)，把基準物的吸光度和待測物激發波長處的吸光度調整到0.1以下，以527 nm為共同激發波長，對各溶液分別進行紫外吸收測定與熒光光譜測定，結果取3次平均值。所得數據代如下列公式進行計算[32]：

公式中F為熒光發射光譜的積分面積，A表示所用激發波長的吸光度，n為樣品溶液的折射系數，下標R與S分別代表基準物與樣品。

1.7 BDP-m-BPA與Zn2+的結合常數測定

結合常數的測定實驗在含不同Zn2+濃度的溶液中進行。溶液中探針BDP-m-BPA的濃度固定為10 μmol·L-1。BDP-m-BPA 的 Zn2+結合常數可根據下式進行擬合[33]：

其中I0是不加Zn2+時BDP-m-BPA在580 nm處熒光強度，I是不同Zn2+濃度時BDP-m-BPA在580 nm處熒光強度。

1.8 BDP-m-BPA的胞內分布和胞內Zn2+造影

造影實驗中所用HeLa細胞在含有10%胚胎小牛血清(FCS，Invitrogen)、青霉素(100 units·mL-1)和鏈霉素 (100 mg·mL-1) 的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)培養基中培養，環境為37℃含5%CO2的空氣。HeLa細胞培養在涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，去掉介質后，細胞用不含金屬的PBS溶液洗滌3次。細胞染色及胞內Zn2+成像實驗步驟如下：把BDP-m-BPA乙醇儲備液稀釋到不含金屬的PBS溶液中，使其最終濃度為10 μmol·L-1。以此溶液室溫孵育HeLa細胞30 min。去除探針溶液后再用不含金屬的PBS溶液洗滌3次，然后用激光共聚焦熒光顯微鏡進行造影。細胞外源鋅的引入利用 ZnSO4/吡啶硫酮(10 μmol·L-1，通過 PBS 稀釋相應5 mmol·L-1儲備液獲得)溶液孵育30 min完成，隨后再次進行熒光造影。造影完畢后，細胞再用50 μmol·L-1TPEN(由TPEN的濃儲液通過 PBS稀釋得到)處理30 min后，再用PBS洗滌一次后進行造影。造影均在Olympus IX81激光共聚焦熒光顯微鏡上完成。激發波長為543 nm,成像通道為560～590 nm。

2 結果與討論

2.1 BDP-m-BPA的Zn2+熒光和吸收光譜滴定

熒光光譜測定發現自由BDP-m-BPA發射光譜顯示2個以575和660 nm為中心的發射峰，其中后一發射峰較寬。隨化合物濃度的增大，前一發射峰幾乎不變，而后一發射峰增強明顯，具有受激締合發射峰的特點 (圖2)，在無α-(4-羥基)苯乙烯結構的BODIPY熒光團中無此發射峰，顯示該結構的引入促進了分子間的締合作用。前一發射峰可指認為BODIPY母體的本征熒光發射。探針的激發光譜顯示化合物具有多個激發峰，其中以527 nm為中心的激發峰波長較長，激發效率適中且不與發射干擾，在后續光譜研究中被選為激發波長。該探針的本征發射峰較普通BODIPY熒光團紅移了近60 nm，而受激締合發射已靠近近紅外發射窗口。激發和發射的向紅變化，這與α-(4-羥基)苯乙烯結構引入擴展了共軛體系、促進分子內ICT效應以及分子締合有關[26]，有利于降低造影中的自發熒光干擾和光毒性。另外本征發射的Stokes位移達到53 nm，也遠大于普通BODIPY的Stokes位移(＜20 nm)。對受激締合發射發射來說Stokes位移更達到133 nm。Stokes位移的增大也有利于減少激發光的干擾。除了300～450 nm間若干個小的吸收峰外，BDP-m-BPA的最大吸收峰出現在596 nm，相對摩爾吸光系數為6.30×104L·mol-1·cm-1。該吸收帶還存在一個位于566 nm的不明顯的肩峰。BDP-m-BPA在596 nm處的最大吸收峰可歸屬為ICT效應導致的吸收峰，比較一般 meso-苯基-1，3，5，7-四甲基取代的 BODIPY的最大吸收(～500 nm)[34]，探針將近100 nm的吸收峰紅移同樣可以認為源于α-位的對羥基苯乙烯基取代增強了分子的ICT效應[26,30]。

圖2 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)中的熒光激發(λem=580 nm)和發射光譜(λex=527 nm)Fig.2 Excitation(λem=580 nm)and emission(λex=527 nm)spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)

圖3 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的熒光滴定圖譜Fig.3 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

在Tris-HCl溶液中的Zn2+熒光滴定結果表明(圖 3)，不斷加入 0.1 倍量的 Zn2+將導致 BDP-m-BPA發射光譜中相對較弱的575 nm處的發射峰不斷增強，并且出現微小的紅移。Zn2+的加入對其ICT發射峰影響不明顯。Zn2+對本征發射峰和ICT發射峰的不同影響顯示該化合物對Zn2+有一定的比例計量響應行為。然而Zn2+加入量較大時本征發射峰增強后會導致與ICT發射峰明顯交疊，使得后者逐漸成為不明顯的肩峰，因此比例計量效應受到干擾，探針主要體現Zn2+增強響應。根據580 nm處探針熒光強度給出的Zn2+滴定曲線表明探針的熒光隨著Zn2+的加入持續增強，雖然熒光增長率在加入6倍探針量的Zn2+后已較小，但未達平衡，這也表明Zn2+與探針的結合能力不強。在紫外光照射下BDP-m-BPA溶液發出紅色熒光，加入6倍探針量的Zn2+之后溶液立即轉為發出黃色熒光，這一現象也表明探針分子對Zn2+的熒光識別可以通過肉眼觀察來實現(圖4)。研究表明探針分子在527 nm光源激發下的量子產率為0.023，而加入6倍Zn2+后可導致BDP-m-BPA的量子產率升高到約為0.16。

圖4 紫外燈照射下 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中對 Zn2+的熒光響應Fig.4 Photograph of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)uopon irradiation by UV lamp of 365 nm

Zn2+熒光滴定結果表明BDP-m-BPA與Zn2+結合主要誘導本征發射強度的增強并逐漸覆蓋基本不變的受激締合發射峰，BDP-m-BPA主要表現為熒光增強型探針。一般在BODIPY衍生物中，meso-位芳環與BODIPY熒光團既不共面也不共軛有關[35]，因此Zn2+離子與meso-芳香氨基配位并不會影響探針分子的受激締合作用。同時由于meso-芳香氨基與BODIPY的隔離使得BPA螯合團對BODIPY存在PET淬滅效應，因此Zn2+導致的探針本征熒光發射增強應源于BPA與Zn2+配位阻斷PET效應。

紫外滴定實驗表明Zn2+的加入對596和566 nm兩處的吸收峰僅有非常微小的影響(圖5)。由于meso-位芳香取代基與BODIPY母體結構既不共面也不參與共軛，因此Zn2+與meso-苯環對位BPA配位不會明顯影響BODIPY母體中的ICT效應。

圖5 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的紫外-可見吸收光譜滴定圖Fig.5 UV-Vis spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

2.2 BDP-m-BPA與Zn2+的結合方式

由于探針與Zn2+的結合能力較弱，不易通過簡單的熒光滴定曲線獲得Zn2+結合比例的有效信息。實際研究中首先通過測定Tris-HCl緩沖溶液中Zn2+與探針的熒光工作曲線來確定探針的Zn2+結合比例。固定BDP-m-BPA和 Zn2+的總濃度為 30 μmol·L-1，通過改變Zn2+與BDP-m-BPA的比例得到不同比值下體系的熒光光譜圖(圖6)。根據580 nm處熒光強度得到的工作曲線顯示熒光強度最大值出現在Zn2+與總濃度比值為0.5處。這一結果表明BDP-m-BPA與Zn2+是以1∶1的計量比結合的。

研究同時還用電噴霧質譜對BDP-m-BPA與Zn2+的配合物進行了研究。如圖7所示，等物質的量混合的BDP-m-BPA和Zn2+混合液的正離子電噴霧質譜顯示兩個主要信號峰，其最高豐度質荷比分別為668.50和790.33。兩信號的同位素分布模式分別與ISOPRO 3.0給出的物種[BDP-m-BPA]+和[BDP-m-BPA+Zn2++AcO-]+的質譜同位素分布模式基本一致，因此可將這兩個質譜信號分別指認為這兩個物種。該結果一方面證實探針BDP-m-BPA與Zn2+是以1∶1的計量比配位結合的，另一方面雖然電噴霧質譜信號豐度不能完全對應溶液中的濃度，但探針本身明顯的質譜信號表明溶液中還存在較多的自由探針分子，這也暗示探針與Zn2+的結合能力一般。

圖6 根據580 nm處熒光強度測定的BDP-m-BPA與Zn2+結合的工作曲線Fig.6 Job plot of BDP-m-BPA-Zn2+complex in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm upon excitation at 527 nm

圖7 BDP-m-BPA與Zn2+1∶1混合液的電噴霧質譜圖Fig.7 ESI-MS spectrum of mixture solution of BDP-m-BPA and Zn2+(1∶1)

為測定BDP-m-BPA與Zn2+的結合常數，根據580 nm處的熒光強度研究中測定了探針結合Zn2+的BenesiHildebrand圖(圖8)。利用公式1對測得的BenesiHildebrand圖進行線性擬合，獲得擬合直線的斜率和截距，由此計算得到 Ka值為～5.4×105L·mol-1(Kd，～1.8 μmol·L-1)。在已報道的以 BPA 為 Zn2+螯合團的Zn2+探針中，以熒光素為熒光團的NG-PDX的Kd值 30～40 μmol·L-1[36],以簡單 BODIPY 為熒光團的 BDA 的 Kd值為 0.1 nmol·L-1[37]，以七甲川菁為熒光團的DPA-Cy的Kd值為60 nmol·L-1[18]。顯然不同的結構組合可以導致BPA螯合團具有不同的Zn2+結合能力。與BDA探針(BPA螯合團氨基氮原子直接連接在meso-C位)相比，BDP-m-BPA中meso-位苯環與BPA氨基氮共軛，降低了其氨基的配位能力，也導致了整個分子的Zn2+結合能力降低。不過由于人體內不同環境的自由Zn2+濃度范圍較大，從pmol·L-1一直跨到 300 μmol·L-1[1]，需要 Zn2+結合能力不同的探針來檢測不同濃度的Zn2+，而BDP-m-BPA正好可以滿足～μmol·L-1水平 Zn2+的檢測。

圖8 BDP-m-BPA在Tris-HCl緩沖液中(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH∶VH2O=1∶1)結合 Zn2+的 Benesi-Hildebrand圖;根據580 nm處熒光測定,激發波長527 nmFig.8 Benesi-Hildebrand plot of BDP-m-BPA binding Zn2+in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm;λex=527 nm

2.3 BDP-m-BPA對不同金屬離子的熒光響應

BDP-m-BPA對不同金屬離子的熒光選擇性響應能力如圖9所示。除Zn2+(6 equiv)對BODIPY本征發射峰有明顯的熒光增強響應外，同族Cd2+和Hg2+(6 equiv)的熒光增強響應非常微弱，而其他測試金屬離子 Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each) 以及Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each)均對探針的熒光光譜無明顯影響。Cu2+僅顯示對受激締合發射峰的淬滅效應，對本征發射峰無明顯影響。這些結果表明該探針對Zn2+具有較好的特異性增強響應能力。

為研究BDP-m-BPA在復雜環境中對Zn2+的熒光檢測的能力，我們還測試了在其他金屬離子存在時探針對Zn2+的增強響應能力。結果發現共存金屬離子如 Hg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each)以及 Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each，圖 10中mix)均對探針的Zn2+熒光增強響應無明顯干擾。Cu2+的存在導致Zn2+誘導的熒光增強效應很小，這可能是由于Cu2+與BPA的結合能力較強，Cu2+、Zn2+共存時Zn2+與探針分子的BPA難以有效結合。以上結果表明BDP-m-BPA可以在含水溶液環境中對Zn2+實現熒光選擇性響應。由于生命體系中“自由”Cu2+的濃度遠低于“自由”Zn2+濃度，因此造影中不會對Zn2+檢測造成明顯的干擾。

圖9 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中對不同金屬離子的熒光響應;Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+各自量是探針的 6倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,其中各離子的量為探針的200倍,λex=527 nmFig.9 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)in the presence of different metal cations;λex=527 nm

低濃度下(1 μmol·L-1)的鋅離子熒光滴定實驗表明BDP-m-BPA在Tris-HCl緩沖溶液中對Zn2+的檢測限(LOD)為 0.18 μmol·L-1，其線性檢測范圍為0.12～1.2 μmol·L-1。由于人體自由鋅離子濃度范圍為 pmol·L-1到 0.3 mmol·L-1，目前顯示的檢測性能表明探針BDP-m-BPA具有合適的靈敏度和良好的線性響應范圍，適合于～μmol·L-1水平自由Zn2+的檢測。

2.4 BDP-m-BPA熒光對pH的依賴性

圖10 金屬離子共存時Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1) 對 Zn2+的增強響應;Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+的含量是探針的 6 倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,各自含量分別是探針的200倍;I580,580 nm處熒光強度。黑色為探針加標記金屬離子時數據,灰色為探針加標記金屬和Zn2+時數據;Blank指探針及其加Zn2+時數據Fig.10 Fluorescent response of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1 ∶1)to Zn2+in the presence of other metal cations;Final concentration for Zn2+,Ag+,Pb2+,Cd2+,Co2+,Fe3+,Cr3+,Hg2+,Mn2+is 60 μmol·L-1each,for Mix,Na+,K+,Ca2+,and Mg2+were added simultaneously and the final concentration for each is 2 mmol·L-1;I580,emission at 580 nm;black bar,data in the presence of the indicated metal cation;gray bar,data in the presence of Zn2+and the indicated metal cation;Blank,the data for free sensor and sensor in the presence of Zn2+

為探討BDP-m-BPA在生物造影中的適用性，我們還進一步研究了其熒光對pH的依賴性。為此分別測定試了探針在不同pH值的C2H5OH/H2O(1∶1，V/V)混合溶液中的熒光強度。圖11(a)顯示了探針在不同pH介質中在580 nm處熒光強度。BDP-m-BPA 在 pH 7.0～12.4范圍內熒光強度較弱也比較穩定。當pH＜7.0時，探針的熒光隨pH降低略有增強，然而在pH6.0以上pH對熒光的影響仍然較小。在pH6.0以下pH降低誘導的熒光逐漸變得明顯，表明BPA氨基質子化導致BPA對BODIPY熒光母體的PET淬滅效應被阻止。上述pH熒光響應行為表明該探針是一個PET探針，低pH值下氨基質子化誘導熒光增強是PET探針的典型表現[27]。正是BDP-m-BPA探針的PET型響應特點導致Zn2+配位的熒光增強效應。BDP-m-BPA/Zn2+配合物在不同pH條件下的熒光測定 (圖11b)表明該配合物在pH 6.33～7.62范圍內顯示相對穩定的熒光增強效應，pH高于或低于該范圍則熒光強度迅速降低。由于在近中性條件下探針熒光及其Zn2+增強效應無pH依賴性。而生命體內大多數微環境的pH值不會偏離中性太多，因此在多數細胞和生物體微環境中BDP-m-BPA將顯示穩定的熒光，不會干擾其Zn2+響應，因此BDP-m-BPA應較為適于細胞造影應用。

圖11 (a)BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)和(b)BDP-m-BPA/Zn2+配合物(10 μmol·L-1)在 580 nm 處熒光強度隨 pH變化圖(VC2H5OH∶VH2O=1∶1);激發波長為 527 nmFig.11 Fluorescent pH titration profile according to the fluorescence intensity at 580nm;λex,527 nm

圖12 BDP-m-BPA染色的HeLa細胞的激光共聚焦造影圖;經BDP-m-BPA染色（10 μmol·L-1in PBS,25℃,30 min）的細胞明場圖Fig.12 Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells stained by BDP-m-BPA(10 μmol·L-1in PBS,25 ℃,30 min)

2.5 BDP-m-BPA對細胞內Zn2+的造影性能

通過對探針染色的HeLa細胞進行激光共聚焦熒光成像進一步研究了BDP-m-BPA對細胞內Zn2+的造影能力。造影選用單通道模式完成，激發波長為543 nm，成像通道為560～590 nm。將HeLa細胞在BDP-m-BPA 溶液中(10 μmol·L-1)中 25 ℃下孵育 30 min，以PBS洗去探針溶液進行細胞造影(圖12b)。熒光圖像顯示在細胞漿中存在點狀分布的熒光區域，一些靠近細胞核的區域具有更高強度的熒光。細胞核中未見明顯的熒光分布。未經探針染色的細胞無論是胞漿還是細胞核中均未見明顯的熒光分布。這表明BDP-m-BPA探針具有良好的細胞膜透過能力，10 μmol·L-1溶液 25 ℃孵育 30 min 可以有效實現細胞的染色。為確認探針在細胞中對Zn2+的增強響應，隨后分別研究了染色細胞在導入外源Zn2+和脫除Zn2+時的造影效果。外源Zn2+的導入是利用ZnSO4/吡啶硫酮(1∶1，10 μmol·L-1)溶液對染色細胞進行進一步孵化(30 min)實現的[38]。造影發現胞漿中熒光發生明顯增強(圖12c)，表明胞漿中探針分子可有效對胞漿中Zn2+水平的提高做出響應。熒光圖片還顯示細胞核中仍未有明顯熒光分布，而已有研究表明ZnSO4/吡啶硫酮孵育可以有效提高HeLa細胞核內的自由Zn2+水平[39]，因此ZnSO4/吡啶硫酮孵育后核中無熒光表明BDP-m-BPA探針在核中沒有分布。負載有外源Zn2+的HeLa細胞的Zn2+脫除是利用具有胞內金屬離子螯合能力的TPEN孵育完成的。熒光造影發現胞漿中熒光相比圖12c中熒光明顯降低(圖12d)，總體熒光強度甚至略低于圖12b中胞漿中熒光強度。這一結果不僅表明TPEN可有效降低胞漿中的自由Zn2+水平，同時也表明BDP-m-BPA在胞漿中可以實現對Zn2+的可逆響應。

3 結 論

本文通過在BODIPY熒光團的meso-位引入Zn2+螯合團和α-位引入(4-羥基)苯乙烯基構建了一個增強型Zn2+熒光探針BDP-m-BPA。探針分子顯示了特異性的 Zn2+熒光增強響應，可在 0.12～1.2 μmol·L-1范圍內線性響應Zn2+。與普通BODIOY類探針相比其激發和發射均出現了明顯的紅移 (激發紅移近～30 nm，發射紅移～70 nm)，同時 Stokes位移達到～50 nm(本征發射)，有利于降低造影中的自發熒光干擾和光毒性，尤其有助于降低普通BODOPY類探針由于Stokes位移小造成的激發干擾。熒光共聚焦造影表明BDP-m-BPA具有良好的細胞膜通透性，可對胞漿中自由Zn2+水平的變化實現可逆跟蹤。本研究不僅發展了一個新的BODIPY類Zn2+熒光探針，而且表明α-(4-推電子基)苯乙烯取代是增強分子ICT效應實現探針激發/發射波長向紅移動和增大Stokes位移的有效手段，有望進一步擴大BODIPY類熒光探針的應用。

[1]Que E L,Domaille D W,Chang C J.Chem.Rev.,2008,108:1517-1549

[2]Vallee B L,Falchuk K H.Physiol.Rev.,1993,73:79-118

[3]Watt N T,Whitehouse I J,Hooper N M.J.Alzheimers Dis.,2010,2011:971021-971031

[4]Jayawardena R,Ranasinghe P,Galappatthy P,et al.Diabetol.Metab.Syndr.,2012,4:13-24

[5]Ho E,Song Y.Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care,2009,12:640-645

[6]Jiang P,Guo Z.Coordin.Chem.Rev.,2004,248:205-229

[7](a)Frederickson C J,Kasarskis E J,Ringo D,et al.J.Neurosci.Methods,1987,20:91-103(b)Nasir M S,Fahrni C J,Suhy D A,et al.J.Biol.Inorg.Chem.,1999,4:775-783(c)Hendrickson K M,Geue J P,Wyness O,et al.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:3889-3895

[8](a)Walkup G K,Burdette S C,Lippard S J,et al.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:5644-5645(b)Burdette S C,Walkup G K,Spingler B,et al.J.Am.Chem.Soc.,2001,123:7831-7841(c)Chang C J,Nolan E M,Jaworski J,et al.J.Chem.Biol.,2004,11:203-210(d)Burdette S C,Frederickson C J,Bu W,et al.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:1778-1787(e)Frederickson C J,Burdette S C,Frederickson C J,et al.J.Neurosci.Methods,2004,139:79-89(f)Nolan E M,Burdette S C,Harvey J H,et al.Inorg.Chem.,2004,43:2624-2635(g)Chang C J,Nolan E M,Jaworski J,et al.Inorg.Chem.,2004,43:6774-6779(h)Woodroofe C C,Masalha R,Barnes K R,et al.Chem.Biol.,2004,11:1659-1666(i)Nolan E M,Jaworski J,Racine M E,et al.Inorg.Chem.,2006,45:9748-9757

[9](a)Hirano,T,Kikuchi K,Nagano T.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:12399-12400(b)Hirano T,Kikuchi K,Nagano T.J.Am.Chem.Soc.,2002,124:6555-6562(c)Komatsu K,Kikuchi K,Kojima H,et al.J.Am.Chem.Soc.,2005,127:10197-10204

[10]Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:12399-12400

[11]Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2000,39:1052-1054

[12]Parkesh R,Clive Lee T,Gunnlaugsson T.Org Biomol.Chem.,2007,5:310-317

[13]Kim S Y,Hong J I.Tetrahedron Lett.,2009,50:2822-2824

[14]Zhao L Y,Mi Q L,Wang G K,et al.Tetrahedron Lett.,2013,54:3353-3358

[15]Mizukami S,Okada S,Kimura S,et al.Inorg.Chem.,2009,48:7630-7638

[16]Li J,Zhang C F,Ming Z Z,et al.Tetrahedron,2013,69:4743-4748

[17]Guo Z,Kim G H,Shin I,et al.Biomaterials,2012,33:7818-7827

[18]Tang B,Huang H,Xu K,et al.Chem.Commun.,2006:3609-3611

[19]Sasaki H,Hanaoka K,Urano Y,et al.Bioorg.Med.Chem.,2011,19:1072-1078

[20]Du P,Lippard S J.Inorg.Chem.,2010,49:10753-10755

[21]Sivaraman G,Anand T,Chellappa D.Analyst,2012,137:5881-5884

[22]Cao J,Zhao C,Wang X,et al.Chem.Commun.,2012,48:9897-9899

[23]Zhu S,Zhang J,Janjanam J,et al.J.Mater.Chem.B,2013,1:1722

[24]Zhang S,Wu T,Fan J,et al.Org.Biomol.Chem.,2013,11:555-558

[25]TIAN Mao-Zhong(田茂忠),PENG Xiao-Jun(彭孝軍),FAN Jiang-Li(樊江莉).Chin.J.Anal.Chem.(分析化學),2006,34:S283-S288

[26]Rurack K,Kollmannsberger M,Daub J.Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40:385-387

[27]Qian F,Zhang C L,Zhang Y M,et al.J.Am.Chem.Soc.,2009,131:1460-1468

[28]Ashokkumar P,Ramakrishnan V T,Ramamurthy P.J.Phys.Chem.A,2011,115:14292-14299

[29]Peng X J,Du J J,Fan J L,et al.J.Am.Chem.Soc.,2007,129:1500-1501

[30]Bozdemir O A,Guliyev R,Buyukcakir O,et al.J.Am.Chem.Soc.,2010,132:8029-8036

[31]Dalpozzo R,De Nino A,Maiuolo L,et al.Aust.J.Chem.,2007,60:75-79

[32]Dutta B,Bag P,Florke U,et al.Inorg.Chem.,2005,44:147-157

[33]Chou C Y,Liu S R,Wu S P.Analyst,2013,138:3264-3270

[34]Gibbs J H,Robins L T,Zhou Z,et al.Bioorgan.Med.Chem.,2013,21:5770-5781

[35]Loudet A,Burgess K.Chem.Rev.,2007,107:4891-4932

[36]Gee K R,Zhou Z L,Ton-That D,et al.Cell Calcium.,2002,31:245-251

[37]Wu Y K,Peng X J,Guo B C,et al.Org.Biomol.Chem.,2005,3:1387-1392

[38]Liu Z,Zhang C,Chen Y,et al.Chem.Commun.,2012,48:8365-8367

[39]Zhang C,Liu Z,Li Y,et al.Chem.Commun.,2013,49:11430-11432