微乳法制備丹皮酚納米結構脂質載體

孫 雯 ，龍凱花 ，李彤暉 ，辛永潔 ，廉志遠 ，李 曄

(1．陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046； 2．陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003）

納米脂質載體，全稱納米結構脂質載體（NLC），是在固體脂質納米粒（SLN）基礎上發展起來的第2代新型給藥系統。NLC保留了SLN生理相容性好，可生物降解，可控制藥物釋放，有良好的靶向性，易于大規模生產的優點[1]；同時，NLC在固體脂質載體中引入了液體脂質，使晶體混亂度增加，獲得了較高的晶體缺陷，克服了SLN載藥量低的問題;另外，許多難溶性藥物在液態脂質中的溶解度要大于固態脂質，因此在NLC固態骨架中形成微小的液態脂質納米格室也有利于載藥量的提高。液態脂質的加入，還改善了SLN的藥物突釋和納米粒混懸體水分含量高的缺點。與SLN相同，NLC的制備方法主要包括高壓乳勻法、微乳法、乳化蒸發-低溫固化法、微乳超聲分散法、薄膜-超聲分散法、溶劑擴散法等[2-5]。微乳是熱力學穩定體系，采用微乳法制備NLC，可使其粒徑大小可控、粒度分布均勻，由于制備速度快，無需在制備后分散，因此試驗裝置簡單、制備條件溫和、操作方便。丹皮酚(paeonol)具有良好的抗炎、抗過敏及抗感染作用，體外用藥素有“天然抗生素”之稱[6]。但丹皮酚具有易揮發、易氧化和生物半衰期短等特性，無法保持持久有效的血藥濃度，影響制劑的穩定性和生物利用度[7-8]。本研究中利用NLC研究了具有緩釋作用的丹皮酚制劑工藝。

1 儀器與試藥

BP-61型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；GL-88B型渦旋混合儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；HJ-6型磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）；SHA-C型恒溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；1026型高效液相色譜儀（安捷倫公司）；FOEA26810D型純水機（MiLLipore公司）。丹皮酚提取物（含量不低于98%，西安天一生物技術有限公司）；丹皮酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 110752-200410）。

2 方法與結果

2．1 液態脂質、乳化劑和助乳化劑的篩選

采用高效液相色譜（HPLC）法[9-10]測定丹皮酚在不同介質中的溶解度，因此選擇對丹皮酚溶解度較大的輔料進行處方篩選。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為甲醇 - 水（70 ∶30），檢測波長為 274 nm，進樣量為 10 μL，流速為 1 mL ／min，柱溫為 30 ℃ 。

溶液制備與測定：精密稱取丹皮酚對照品5．90 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成每1 mL含0．590 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取過量丹皮酚細粉置10 mL具塞試管中，分別加入各種液態脂質、表面活性劑及助表面活性劑約1．0 g，密封，磁力攪拌混勻，于（42±1）℃水浴搖床中振蕩至平衡后，以12 000 r／min的速率離心10 min，取上清液200 μL，置容量瓶中，精密稱定，甲醇溶解并稀釋至刻度，HPLC法檢測藥物含量，計算丹皮酚在各輔料中的飽和溶解度。平行測定3份，結果見表1。

篩選結果：液態脂質中油酸乙酯(EO)，油酸(AO)，辛酸葵酸三甘油酯(GTCC)對丹皮酚溶解度均較高，但黏度大的脂質不利于在水相中分散，乳化平衡所需時間較長，因此，用黏度較小的油相為佳[8]。因以可進一步考察微乳形成性能考察的液態脂質有油酸乙酯，GTCC，油酸聚乙醇甘油酯(LabrafiL M1944CS)，單亞油酸甘油酯(Maisine 35-1)，肉豆蔻異丙酯(IPM)；乳化劑有聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(HS-15)，辛酸癸酸乙二醇甘油酯(LabrasoL)，聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40)；助乳化劑有甘油，二乙二醇單乙基醚(TranscutoL P)，聚乙二醇400(PEG400)，無水乙醇。

表1 丹皮酚在不同油、表面活性劑和助表面活性劑中的表觀溶解度（42℃，n＝3）

2．2 偽三元相圖的繪制

不同固態脂質對初乳液（微乳）形成的影響：以油酸乙酯為液態脂質，考察固態脂質硬脂酸、單硬酯酸甘油酯對初乳液形成的影響，并繪制偽三元相圖，見圖1。可見，兩種固態脂質形成微乳液的面積與其加入量呈負相關；硬脂酸的 O／W型微乳面積明顯大于單硬酯酸甘油酯。

圖1 不同固態脂質對初乳液的影響

不同液態脂質對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態脂質，考察液態脂質 GTCC，LabrafiL M 1944CS，油酸乙酯，Mainsine 35-1，IPM對初乳液形成的影響，并繪制偽三元相圖，見圖2。可見，5種乳化劑均能形成微乳，其中GTCC，油酸乙酯，IPM的偽三元相圖下微乳面積較大。

不同乳化劑對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態脂質，油酸乙酯為液態脂質，考察乳化劑泊洛沙姆，LabrasoL，RH-40，HS-15，卵磷脂對初乳液形成的影響，繪制偽三元相圖，見圖3。可見，卵磷脂和泊洛沙姆188不能形成微乳；偽三元相圖下，HS-15形成的微乳面積最小。

圖2 不同液態脂質對初乳液的影響

圖3 不同乳化劑對初乳液的影響

不同助乳化劑對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態脂質，油酸乙酯為液態脂質，考察助乳化劑 PEG400、1，2-丙二醇、TranscutoL P、無水乙醇、甘油對初乳液形成的影響，繪制偽三元相圖，見圖4。可見，各助乳化劑均能不同程度地形成微乳液。但考慮到乙醇的皮膚刺激性，因此后續篩選將不列入無水乙醇。

圖4 不同助乳化劑對初乳液的影響

2．3 過冷態處方的去除

對偽三元相圖篩選出的9個微乳處方進行“過冷態”處方試驗，凡不能在0℃冷水中分散，形成混懸液的，即認為是“過冷態”處方，對其舍棄。結果見表2。

表2 待選處方組成及其0℃分散表觀性狀表

2．4 載藥微乳液的制備

按表 2 中 1，2，3，5，6 處方，在（42 ±1）℃ 水浴下加入 10% 丹皮酚藥物，以微乳液仍澄清透明、離心后不分層為指標評定可載藥微乳液。結果表明，加入丹皮酚后，處方 1，2，6流動性好，離心后不分層，可作為制備丹皮酚NLC備用處方。處方3，4離心后分層，舍去。

2．5 丹皮酚NLC的制備

取處方量硬脂酸和油酸乙酯（42±1）℃加熱混勻，加入10%丹皮酚，磁力攪拌，加入處方量LabrasoL，TranscutoL P和水制備成澄明丹皮酚NLC微乳液，并將其加熱至60℃以上，用預熱至同樣溫度的注射器吸取1 mL微乳液，逐滴快速分散于10 mL的0℃冷水中，即形成丹皮酚NLC混懸液。

3 討論

本試驗在丹皮酚的NLC制備方法上采用了微乳法，此方法制備NLC的初乳液所需設備簡單、操作方便易行。試驗前期結果表明，硬脂酸、單硬脂酸甘油脂等固態脂質的最低熔點約在40℃，而丹皮酚晶體在45℃即可熔融成液態，因此對各介質溶解性能的考察溫度應設定在40～45℃。采用繪制偽三元相圖篩選微乳初乳液處方。分別對構成處方的固態脂質、液態脂質、乳化劑、助乳化劑進行微乳液的滴定，初選構成處方輔料。通過加藥粉、過冷液等試驗，篩選出備選處方。通過體外經皮滲透試驗，優選透皮滲透率高、突釋現象較弱的處方。文獻報道，NLC的分散粒徑和初乳液與分散液的溫差呈負相關，即初乳液與分散液的溫差越大，形成的NLC粒徑越小；分散時乳滴越小，越容易均勻分散，分散粒徑趨向于小。對此，NLC的分散工藝還有待進一步考察。所謂“過冷態”，即溫度降至脂質熔點以下時類脂不發生結晶現象。本試驗制備NLC初乳液產生過冷態的原因主要有混合脂質作為載體材料降低了結晶度，打破晶格的有序性；粒徑太小及乳化劑的加入，導致類脂凝固被阻滯。NLC過冷態的形成會嚴重影響緩釋效果，因此對形成過冷態處方的篩除非常重要。

微乳具有穩定的納米級結構，但仍然存在油水界面，表面活性劑在油相、水相和界面間快速交換，達到一種動態平衡。微乳稀釋冷卻時，表面活性劑將向分散介質迅速擴散而流失。失去部分表面活性劑保護的微乳中未固化的脂質油相互融合使粒徑增加。已形成的納米粒也會隨處方不同穩定性有差異。縮短固化時間有利于得到粒徑小、穩定性好的產品。

微乳是一種熱力學穩定體系，其制備速度快，且無需在制備后立即分散，使得NLC制備工藝操作更加靈活。由于注射器針尖滴出的微乳液滴可以很小，每滴與分散介質接觸時都能保證較高的稀釋倍數。因此微乳法制備NLC時總的稀釋倍數可以很小，甚至小于1。其產品的脂質濃度可以比溶劑乳化法高，但仍比高壓乳勻法小[4]。乳化劑用量大是微乳法制備NLC的一個缺點。表面活性劑可以考慮用透析或超速離心等方法除去。本試驗制得的丹皮酚NLC同時具有緩釋作用，可以制成親水凝膠和軟膏而用于局部給藥[11]。

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