五味子多糖膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性研究

閆 舒 ，仰榴青 ，趙 婷

（1．江蘇省鎮(zhèn)江市藥品檢驗所，江蘇 鎮(zhèn)江 212003； 2．江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

五味子多糖膠囊以木蘭科植物五味子醇提后的藥渣為生產(chǎn)原料，經(jīng)提取加工制得，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化、調(diào)血脂等功效[1-4]。本課題組前期對五味子多糖膠囊的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化選擇[5]。為有效控制制劑質(zhì)量，保證臨床療效，本試驗中制訂了五味子多糖的鑒別和含量測定方法，并對樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步考察，以期為五味子多糖膠囊的質(zhì)量控制、生產(chǎn)包裝、貯存及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-7502 PC型紫外-可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；人工氣候箱（上海一恒科技有限公司）；101-3-S型數(shù)字控溫烘箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。五味子多糖膠囊（實驗室自制，批號為 090312，090324，090408）；葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為145322-200508）；鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量均大于95%）；5%苯酚溶液（配制方法[6]為取苯酚100 g加鋁片0．1 g和碳酸氫鈉0．1 g蒸餾，收集182℃餾分，稱取次餾分5 g加95 mL蒸餾水，置棕色瓶中，得濃度為5%的苯酚試液）；95%乙醇、苯酚、濃硫酸等均為市售分析純（江蘇省鎮(zhèn)江市華東化玻有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2．1 理化鑒別[7]

2．1．1 堿性酒石酸銅

取本品10 mg，研細(xì)，置試管中，加堿性酒石酸銅試液2 mL，置沸水浴中加熱10 min，濾過，取濾液加6 mol／L鹽酸2 mL，置沸水浴中加熱20 min，冷卻，加10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH＝7，加堿性酒石酸銅試液2 mL，置沸水浴中加熱，有棕紅色沉淀生成。

2．1．2 Molish 反應(yīng)

取本品 10 mg，研細(xì)，置試管中，加入2滴 Molish試劑，搖勻，將試管傾斜，沿試管壁慢慢加入1 mL濃硫酸，豎直試管，濃硫酸和糖交界面有紫色環(huán)生成，以蒸餾水為陰性對照，淀粉為陽性對照，結(jié)果陰性無干擾。

2．2 薄層色譜(TLC)鑒別

精密稱定鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸對照品各1 mg，溶于1 mL蒸餾水中，得1 g／L的各單糖對照品溶液。分別稱取鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸對照品各0．5 mg，共溶于2 mL蒸餾水，制得混合單糖對照品溶液。取五味子多糖及輔料糊精各10 mg，加入2．0 mol／L的硫酸溶液 6 mL，酒精噴燈封管，100℃水解 8 h，取出，加入碳酸鋇中和，以3 000 r／min的速率離心，除去硫酸鋇沉淀，冷凍干燥上清液即得各多糖的水解溶液(供試品溶液)。

取已配好的單糖對照品溶液、混合單糖對照品溶液及供試品溶液，分別點(diǎn)于含0．3 moL／L磷酸二氫鈉的硅膠G板上，以正丁醇 -丙酮 -水（4∶3∶1）為展開劑展開，展距 15 cm，取出，晾干后，以苯胺-鄰苯二甲酸顯色[將鄰苯二甲酸1．6 g溶于水飽和正丁醇溶液 100 mL，加苯胺 0．93 g（相當(dāng)于 0．9 mL）]。按公式計算 Rf值（Rf＝起始線到斑點(diǎn)的距離／起始線到溶劑前沿的距離）。

由圖1薄層板和各樣品薄層色譜的 Rf值（見表1）可見，樣品多糖溶液色譜中斑點(diǎn)顏色、位置與標(biāo)準(zhǔn)混合單糖中半乳糖、葡萄糖和甘露糖斑點(diǎn)一致；糊精樣品溶液色譜中斑點(diǎn)顏色、位置與標(biāo)準(zhǔn)混合單糖中葡萄糖斑點(diǎn)一致。因此，五味子多糖膠囊內(nèi)容物中可見半乳糖、葡萄糖和甘露糖斑點(diǎn)。

圖1 薄層色譜圖

表1 各標(biāo)準(zhǔn)單糖和樣品薄層色譜的 Rf值

2．3 含量測定

2．3．1 測定條件

樣品處方中，五味子多糖為主要有效成分，故本試驗重點(diǎn)應(yīng)用苯酚-硫酸法建立適合本品的專屬、可靠的測定方法，監(jiān)測膠囊中多糖的含量，以控制藥品質(zhì)量。顯色條件為供試品溶液加5%苯酚溶液混合后再加濃硫酸，混勻，30℃水浴中顯色30 min，即可測定，測定波長為490 nm。

2．3．2 溶液制備

精密稱取五味子多糖膠囊內(nèi)容物5．0 mg，蒸餾水定容至25 mL，分別吸取0．6 mL稀釋糖液，加入5%苯酚溶液1．2 mL混合后加入濃硫酸6．0 mL，充分混勻后，30℃水浴下放置 30 min，即得供試品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[8]：精密稱取干燥的葡萄糖20 mg，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（每1 mL溶液中含葡萄糖0．2 mg）。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 7．5，10．0，12．5，15．0，20．0 mL 置25 mL容量瓶中，蒸餾水定容。吸取0．6 mL稀釋糖液，分別加入5%苯酚溶液1．2 mL和濃硫酸6．0 mL。將充分混勻的各溶液置30℃水浴中放置30 min，另以蒸餾水同法操作制備空白對照溶液，按分光光度法于490 nm波長處測定各溶液的吸光度。以各溶液的吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程 A＝55．785 C ＋0．053 5（r＝0．999 8）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0．004 6～0．012 3 g／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取葡萄糖對照品溶液（質(zhì)量濃度為0．2 g／L）15 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別吸取0．6 mL稀釋糖液，加入5%苯酚溶液1．2 mL混合后加入濃硫酸6．0 mL，充分混勻后，30℃水浴下放置30 min。另以蒸餾水同上操作為空白對照溶液，在490 nm波長處測定吸光度，重復(fù)測定5次。結(jié)果葡萄糖吸光度的 RSD為0．20%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密稱定五味子多糖膠囊（批號為090324）內(nèi)容物5 mg，蒸餾水定容至25 mL，配制成供試品溶液。分別于配制后每20 min吸取0．6 mL稀釋糖液，按擬訂方法進(jìn)行測定。結(jié)果葡萄糖吸光度的 RSD為0．15%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱定五味子多糖膠囊（批號為090324）內(nèi)容物5份，依法制備供試品溶液，顯色，在490 nm波長處測定吸光度。結(jié)果葡萄糖吸光度的 RSD為0．43%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的同一批（批號為090324，含量為每粒171．4 mg）樣品20 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL制備供試品溶液。分別精密加入葡萄糖對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0．2 g ／L）10，15，20 mL，各平行加入 3 次，按擬訂方法進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n＝9)

2．3．4 樣品含量測定

精密稱取不同批號的樣品，依法制備供試品溶液，測定3批樣品中多糖的含量。結(jié)果批號為090312，090324，090408的3批樣品中多糖平均含量分別為每粒 182．8，171．4，186．4 mg，RSD 分別為 1．05% ，0．72% ，1．04% 。

2．4 穩(wěn)定性研究

2．4．1 影響因素試驗[9]

光照試驗：取五味子多糖膠囊（批號為090324）20粒，傾出內(nèi)容物，平攤于稱量瓶中，精密稱定后開口置頂部裝有20 W節(jié)能燈的木箱中，距燈底部約15 cm，經(jīng)自動換檔數(shù)字式照度計測得稱量瓶處照度為4 500 Lx。于第0，5，10天取樣考察內(nèi)容物的外觀、水分含量和總糖含量，結(jié)果見表3。可見，在強(qiáng)光照射下五味子多糖膠囊的內(nèi)容物水分增加不明顯，總糖含量至第10天下降了9．21%，表明光照對五味子多糖膠囊質(zhì)量無明顯影響。

表3 光照對膠囊劑穩(wěn)定性的影響

高溫試驗：取五味子多糖膠囊（批號為090324）20粒，傾出內(nèi)容物，平攤于稱量瓶中，密塞。精密稱定后置60℃恒溫人工氣候箱中放置，于第0，5，10天取樣考察外觀、水分含量和總糖含量，結(jié)果見表4。可見，五味子多糖膠囊內(nèi)容物在60℃放置，水分基本無變化，而總糖含量在第10天下降了15．47%，表明溫度對五味子多糖膠囊質(zhì)量有一定影響。

表4 溫度對膠囊劑的穩(wěn)定性影響

高濕試驗：取五味子多糖膠囊（批號為090324）20粒，傾出內(nèi)容物，平攤于稱量瓶中，精密稱定后置預(yù)先恒溫（25℃）狀態(tài)下盛有的氯化鈉飽和水溶液（RH 75%）的干燥器中，分別于第0，5，10天后取樣考察顏色、性狀、水分含量和總糖含量，結(jié)果見表5。可見，五味子多糖膠囊內(nèi)容物在RH 75%環(huán)境下放置3 d就有輕微的結(jié)塊現(xiàn)象，至第10天結(jié)塊現(xiàn)象嚴(yán)重，水分增加至4．97%，總糖含量下降了25．49%，表明濕度對五味子多糖膠囊的穩(wěn)定性有明顯的影響。

表5 濕度對膠囊劑穩(wěn)定性的影響

各項影響因素試驗表明，本品對高濕和高溫不穩(wěn)定。因此本品貯藏條件規(guī)定為“密封，陰涼干燥處保存”。

2．4．2 加速試驗[10]

模擬上市包裝試制3批（批號為090312，090324，090408）五味子多糖膠囊。將供試品在溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的條件下放置6個月。在試驗期間第1，2，3，6個月末分別取樣1次，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項目檢測。結(jié)果見表6。可見，本品加速試驗6個月，各項指標(biāo)均符合規(guī)定，故認(rèn)為本品包裝基本能保證藥品的質(zhì)量，暫訂該膠囊的有效期為2年[11]。

表6 樣品加速試驗結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)外對五味子多糖的研究大多集中在粗多糖的提取及定量測定方面[12-13]，而對其單一多糖組分純化及鑒定的研究還很少。TLC法設(shè)備簡單、操作方便，是一種快速、微量的分離技術(shù)，實驗室較常用。由于糖是多羥基化合物，極性強(qiáng)容易吸附，多采用含有無機(jī)鹽水溶液制備硅膠薄層板，本試驗中采用加入磷酸二氫鈉以增加多糖在固定相中的溶解度。定性鑒別結(jié)果顯示，五味子多糖膠囊內(nèi)容物中可見半乳糖、葡萄糖和甘露糖斑點(diǎn)，而據(jù)文獻(xiàn)報道，五味子純化多糖SCP-BⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸組成，其摩爾比為鼠李糖 ∶阿拉伯糖 ∶甘露糖 ∶半乳糖 ∶葡萄糖 ∶半乳糖醛酸 ＝4．7 ∶2．6 ∶0．8 ∶5．6 ∶1 ∶5．6[14]。由于薄層色譜的靈敏度有限，水解后的單糖在總糖中所占比例較小的單糖在薄層中往往不能顯出斑點(diǎn)，要進(jìn)一步獲得單糖的組成及比例，應(yīng)通過氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

五味子多糖膠囊以五味子多糖為主要有效成分，故本試驗重點(diǎn)運(yùn)用目前常用的苯酚-硫酸法建立適合本品的專屬、可靠的含量測定方法，監(jiān)測膠囊中多糖的含量，以達(dá)到控制藥品質(zhì)量的目的。

五味子多糖膠囊的穩(wěn)定性試驗方法，是根據(jù)2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪⅩC原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則中有關(guān)內(nèi)容制訂的。各項影響因素試驗表明，本品對高濕和高溫不穩(wěn)定，因此本品貯藏條件規(guī)定為“密封，陰涼干燥處保存”。

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