血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-β在人絨毛膜癌中的作用研究

伍彩雯 楊 采蓮 王 永榮 高新明

絨毛膜癌其病理成分主要為合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，屬于惡性程度極高的腫瘤，缺少絨毛組織，極易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移，特別是早期肺部轉(zhuǎn)移，化療對(duì)該病具有良好的作用，但是在長(zhǎng)期的化療過(guò)程中患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)和腦轉(zhuǎn)移等情況，因而病死率較高［1，2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-β(VEGF-β) 即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-B，屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，可通過(guò)與樣酪氨酸激酶-1的結(jié)合而發(fā)生作用。研究認(rèn)為VEGF-β可通過(guò)影響內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)來(lái)介導(dǎo)腫瘤新生［3］。有關(guān)研究指出VEGF-β主要在胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等惡性腫瘤的邊緣呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常人血漿中只有少量表達(dá)，因此VEGF-β與腫瘤細(xì)胞的侵襲力密切相關(guān)［3］。但是目前相關(guān)的研究和報(bào)道并不多見(jiàn)，本文以人絨毛膜癌株JAR和JEG-3為模型，觀察VEGF-β mRNA的表達(dá)與人絨毛膜癌的關(guān)系，為臨床基因治療絨毛膜癌轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 細(xì)胞株:JAR來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，JEG-3來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑 Falcon公司的15 ml和10 ml一次性離心管和一次性移液管、6well細(xì)胞培養(yǎng)板、25 cm2一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶;Eppendorf公司的1.5 ml eppendorf管和9600PCR管;TaKara公司的25 mmol/L MgCl2和10*PCR buffer及10 mmol/L dNTP Mix;上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的Taq DNA Polymerase;SABC公司的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)入DNA/Hindl;Takara公司的DNAMarkerDL2000及RT-PCR試劑盒;promega公司的Reverse Transcription system Kit、溴化乙錠(EB);Invitrogen公司的lipofeetamineTM2000;Sigma公司的焦碳酸二乙酉旨(DEPC)、普通瓊脂糖(agarose);天津?yàn)l洋生物制品有限公司的苯酚;湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠的無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇;Gibco BRL公司的Trizol;Difco公司的胰酶;GIBCO公司的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基;杭州四季青生物技術(shù)公司的小牛血清;Coming Costar公司的Transwell侵襲小室(24孔板，濾膜孔徑8 μm);北京大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系Matrigel凝膠(3.5 μg/μl);invitrogen 公司的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000;武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司的針對(duì)人VEGF-β基因的靶向shRNA及Fermentas公司的25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L dNTP Mix、Taq DNA Polymerase［4，5］。儀器包括制冰機(jī)、PCR 儀、Gel Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)、微量加樣器、電動(dòng)移液器、－80℃冰箱、高速離心機(jī)、微波爐等。晶賽公司以VEGF-β為靶基因涉及的DNA兩條序列，以轉(zhuǎn)染的shRNA為陰性對(duì)照組，反義序列:5’-AAAGGACAGUGCUGUGAAGCCAGACAA-3’正 義 序 列:5’-AAUUUCCUGUCACGACACUUCGGUCUG-3’PCR 擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.3 方法 將兩種細(xì)胞分別在飽和濕度、溫度37℃、95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中于10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液1～2 d更換1次，細(xì)胞繁殖近瓶底70%～80%時(shí)傳代1次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞侵襲力差異 在進(jìn)行Matrigel體外侵襲力的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞侵襲力通過(guò)Transwell膜的透過(guò)情況來(lái)衡量，研究結(jié)果顯示JAR細(xì)胞零散分布于Transwell膜，且數(shù)量較少，而JEG-3細(xì)胞穿過(guò)Transwell膜的數(shù)量較多，分布較為密集，經(jīng)比較兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩種細(xì)胞侵襲力比較±s

表2 兩種細(xì)胞侵襲力比較±s

組別 透膜數(shù) 試驗(yàn)次數(shù) t值 P值JAR 105 ±15 5 12.729 ＜0.05 JEG-3 218±13 5

2.2 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA 差異的PT-PCR 檢測(cè) 研究合成VEGF-β引物，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析，計(jì)算GAPDH和VEGF-β的光密度值，結(jié)果顯示JEG-3細(xì)胞內(nèi)VEGF-β mRNA明顯高于JAR細(xì)胞，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差異的PT-PCR檢測(cè)±s

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差異的PT-PCR檢測(cè)±s

組別 VEGF-β mRNA 試驗(yàn)次數(shù) t值 P值JAR 0.472 ±0.04 5 31.3 ＜0.05 JEG-3 1.724 ±0.08 5

2.3 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞內(nèi)VEGF-β mRNA情況 研究顯示轉(zhuǎn)染shRNA在JEG-3的細(xì)胞抑制方面具有明顯的作用，與對(duì)照組和非特異性shRNA相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)照組與非特異組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)VEGF-β mRNA情況±s

表4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)VEGF-β mRNA情況±s

注:與試驗(yàn)組比較，*P ＜0.05

組別 VEGF-β mRNA 灰度值 試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)組(shRNA)0.43 ±0.04 5對(duì)照組(空白對(duì)照) 1.68 ±0.08* 5非特異 shRNA 組 1.68 ±0.09*5

2.4 轉(zhuǎn)染后3組侵襲力差異 以Matrigel體外侵襲實(shí)驗(yàn)獲得的Transwell膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反應(yīng)侵襲力強(qiáng)弱，研究顯示，試驗(yàn)組較對(duì)照組和非特異組穿膜數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。見(jiàn)表5。

表5 轉(zhuǎn)染后各組侵襲力差異±s

表5 轉(zhuǎn)染后各組侵襲力差異±s

注:與試驗(yàn)組比較，*P ＜0.05

組別 穿膜細(xì)胞數(shù) 試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)組(shRNA)106±9 5對(duì)照組(空白對(duì)照) 223±11* 5非特異組shRNA組 215±13*5

3 討論

人類滋養(yǎng)細(xì)胞與體細(xì)胞的特殊細(xì)胞不同，它具有特殊的生物學(xué)特性和繁殖特點(diǎn)，正常妊娠的滋養(yǎng)細(xì)胞受時(shí)間和空間的調(diào)控呈現(xiàn)一定的侵襲力，而當(dāng)發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤時(shí)，此時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞則失去時(shí)間和空間的控制，特別是絨毛膜癌，侵襲轉(zhuǎn)移和播散的能力特別強(qiáng)。目前研究認(rèn)為，正常的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲對(duì)維持妊娠順利進(jìn)行具有重要作用，但是當(dāng)侵襲不收控制時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致一些列婦科妊娠相關(guān)疾病，嚴(yán)重者危及患者生命［6，7］。目前由于化療過(guò)程中出現(xiàn)的副反應(yīng)和腦轉(zhuǎn)移嚴(yán)重制約了該疾病的治療，因此降低絨毛膜癌的侵襲力，控制和防止其轉(zhuǎn)移能力則成為臨床醫(yī)學(xué)界的一大難題，本研究經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明JEG-3的侵襲力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于JAR細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，這提示VEGF-β有可能是絨毛膜癌侵襲的重要因子，這與相關(guān)研究相似，而有研究認(rèn)為VEGF-β會(huì)通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、增加瘤供血能力和運(yùn)動(dòng)能力及癌細(xì)胞基底膜穿透能力來(lái)參與絨毛膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，shRNA則對(duì) JEG-3的侵襲起到了抑制的作用［7］?？傊?，VEGF-β可以增加人絨毛膜癌的侵襲力，而VEGF-β shRNA則對(duì)其侵襲力起到了一定的抑制作用，因此在人絨毛膜癌的治療中VEGF-β的治療，將成為該病新的治療方式。

1 段娥，王芳，李英勇.1α，25-二羥基維生素D3對(duì)絨毛膜癌細(xì)胞株JAR的影響及其機(jī)制.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2011，20:614-617.

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