不同抗生素對刺槐遺傳轉化受體系統的影響

2014-07-18 10:26:39韓義等

山東農業科學 2014年4期

韓義等

摘要：

本試驗研究了卡那霉素（Kana）、頭孢霉素（Cef）、氨芐青霉素（Amp）、羧芐青霉素（Carb）、紅霉素（E）對刺槐形成層為外植體的遺傳轉化受體系統的影響。結果表明：刺槐形成層誘導愈傷時Cef對受體材料傷害最小，抑菌效果最好，濃度為200 mg/L時能完全抑制農桿菌生長；用Kana作為刺槐轉基因植株的篩選，刺槐形成層愈傷組織分化時選擇劑濃度為100～125 mg/L最佳，生根培養時選擇劑濃度為75 mg/L最佳。

關鍵詞：刺槐；遺傳轉化；抗生素；形成層

中圖分類號：S792.270.4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0031-05

刺槐（Robinia pseudoacacia L.），適應性強，生長快，材質好，用途廣，繁殖容易，是人工造林的優選樹種[1]，但其有限的耐鹽能力卻限制其栽種范圍。應用基因工程技術提高刺槐耐鹽性是拓展其用于重鹽堿地區造林和綠化的重要途徑。我們從刺槐中克隆了定位于液泡膜的Na+/H+逆向轉運蛋白基因RpNHX1，并構建含35S強啟動子表達載體pBI121-RpNHX1用于刺槐遺傳轉化。

在植物遺傳轉化的多種技術中，農桿菌介導的轉化方法因其操作簡單、轉化率高、拷貝數少等優點成為常用的有效轉化方法，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化[2～6]。應用農桿菌介導法進行植物遺傳轉化時，一般經過農桿菌侵染、共培養、選擇培養、轉基因植株再生等多個環節，除侵染和共培養外，其余環節都要用到抗生素作為篩選轉化體的抗性選擇劑和農桿菌生長的抑制劑，因此研究抗生素對遺傳轉化受體系統的影響是遺傳轉化受體系統建立的必經環節[7，8]。不同種類抗生素抑菌效果不同，對受體材料影響也不同，因此抗生素種類選擇和劑量方案都需要在實驗中加以確定。目前遺傳轉化中常用的抑菌類抗生素主要有頭孢霉素（Cefotaxime， Cef）、氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）、羧芐青霉素（Carbenicillin， Carb）、紅霉素（Erythromycin， E）等。抑菌類抗生素通常用以防止遺傳轉化過程中農桿菌過度增殖對植物細胞造成傷害和雜菌污染。選擇抑菌類抗生素既要有效抑制農桿菌的生長還要最大限度減少對受體材料的影響。選擇性抗生素用于轉基因植株的篩選和檢測，這類抗生素的選擇只能根據轉基因植株所攜帶的抗性基因決定，我們構建的表達載體pBI121-RpNHX1含有編碼npt Ⅱ基因（提供卡那霉素抗性），因此本試驗選卡那霉素（Kanamycin， Kana）用于轉基因植株的篩選和檢測。本研究的目的是確定農桿菌介導RpNHX1基因在刺槐遺傳轉化過程中抑菌劑的種類和最佳劑量方案，以及用于不同階段進行抗性篩選的卡那霉素劑量方案，為下一步進行遺傳轉化提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試刺槐為山東農業大學篩選的刺槐耐鹽優良無性系W009，2008年定植于山東農業大學林學試驗站。農桿菌菌株LBA4404含重組質粒pBI121-RpNHX1具卡那霉素抗性，構建于2012年4月，-70℃保存，其中載體pBI121由山東農業大學教授樊金會惠贈。供試卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢霉素、紅霉素購于SIGMA公司。

1.2 不同抗生素對農桿菌的抑制作用

挑取含重組質粒的LBA4404單菌落于2 mL YEP液體培養基中振蕩培養活化（28℃，200 r/min）過夜，取1 mL新鮮菌液接種于50 mL YEP培養基中，培養至對數生長期，3 000 r/min離心5 min收集菌體，并重懸稀釋菌體至OD600值為0.6。取直徑1 cm左右刺槐莖段截成3～5 cm小段，用洗潔凈水浸泡10 min，軟毛刷清洗表面，流水沖洗2 h，在超凈工作臺上滅菌，70%酒精30 s，0.1%升汞3 min，無菌水沖洗7～8遍，用無菌濾紙吸干表面水分后刮去表皮，取形成層切成0.5 cm×0.5 cm小塊，形成層內側向下貼在培養基表面，預培養24 h后，在超凈工作臺上取出于菌液中侵染10 min，用無菌濾紙吸去多余菌液，共培養3 d后接入含有抑菌類抗生素的培養基中。7 d觀察記錄一次，30 d后統計結果。樣本容量為40，重復3次，培養溫度25℃、空氣相對濕度60%、光照8 h/d、光強1 000 lx。

1.3 抗生素對刺槐形成層愈傷組織誘導試驗

將滅菌后的外植體（材料及方法同上）接種于含不同濃度的Amp、Carb、E、Cef的誘導培養基WPM+1.2 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。對照為不加抗生素。7 d觀察記錄一次，30 d后統計分化情況。樣本容量為40，重復3次，培養溫度25℃、相對濕度60%、光照8 h/d、光強1 000 lx。

1.4 Kana對刺槐形成層愈傷組織分化的影響

將刺槐形成層誘導形成的愈傷組織切成0.5 cm2左右小塊接種于含不同濃度Kana的分化培養基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。對照為不加抗生素。7 d觀察記錄一次。樣本容量為40，重復3次，培養溫度25℃、相對濕度60%、光照14 h/d、光強1 500 lx。

1.5 Kana對刺槐瓶苗生根試驗

將繼代兩次的瓶苗接種于MS空白培養基進行復壯后，截成1～2 cm帶芽小段接種于含不同濃度Kana的生根培養基1/2MS+1.2 mg/L IBA+1.5%蔗糖+1.0～2.0 g/L活性炭中。7 d觀察記錄一次，20 d后統計生根率。

2 結果與分析

2.1 抑菌劑的選擇及最佳抑菌濃度確定

2.1.1 抗生素Cef、Amp、Carb、E對刺槐形成層誘導愈傷的影響統計結果表明，抗生素濃度在50～250 mg/L范圍內，隨著培養基中抗生素濃度的升高，刺槐形成層愈傷組織誘導及分化率呈下降趨勢，刺槐形成層對四種抗生素敏感程度不同。四種抗生素對刺槐形成層誘導愈傷的抑制作用 Amp>Carb>Cef、E。Cef、E比Amp和Carb更適合做刺槐形成層誘導愈傷的抑菌劑（圖1）。

2.1.2 抗生素對農桿菌的抑制作用農桿菌侵染過的刺槐外植體接種到誘導培養基中，如果農桿菌過度增殖就會對外植體產生毒害作用甚至使其變褐死亡。因此在培養基中加入抗生素抑制農桿菌的生長是必不可少的。試驗結果（表2）表明，四種抗生素抑菌作用Cef>Amp、Carb>E。Cef抑菌效果最優，濃度達到200 mg/L時已經完全抑制農桿菌的生長。

抑菌劑的選擇要綜合考慮其對農桿菌的抑菌效果和對外植體的影響。分析圖1四種抗生素均會對刺槐形成層誘導愈傷組織產生抑制作用，但敏感程度不同，在低濃度下（50 mg/L）Amp和Carb對刺槐形成層誘導愈傷組織產生抑制作用，誘導率分別為67.5%和82.5%，低于對照（92%）；相同濃度的Cef和E對愈傷組織誘導的抑制不明顯，誘導率分別為92.5%和92.0%。隨著抗生素濃度的增加，愈傷組織誘導率均有下降，但相同濃度下添加Cef和E的愈傷組織誘導率要明顯高于添加Amp和Carb。在抗生素濃度為200 mg/L時培養基中添加Cef和E的愈傷組織誘導率仍維持在65%的較高水平，而相同濃度Amp和Carb愈傷組織誘導率分別為22.5%和42.5%。四種抗生素對農桿菌的抑菌效果為Cef>Amp、Carb>E，綜合考慮，Cef最適合作為刺槐形成層為外植體的遺傳轉化的抑菌劑，最佳抑菌濃度為200 mg/L。

2.2 選擇劑Kana濃度的確定

2.2.1 Kana對刺槐形成層愈傷組織分化的影響在再分化培養基中添加Kana能明顯抑制刺槐形成層愈傷組織分化產生不定芽。在不添加Kana的培養基中，愈傷組織培養2周開始分化產生不定芽，分化率為12.5%，培養5周后分化率高達87.5%（表2、圖2f）。在添加Kana 50 mg/L的培養基中，隨培養時間延長，愈傷組織開始出現變褐死亡的現象，培養5周仍有22.5%愈傷組織分化產生不定芽。隨著Kana濃度增加，愈傷組織分化率降低，愈傷組織出現死亡的時間提前，死亡率升高。當Kana濃度達到100 mg/L時，愈傷組織死亡率高達75.0%，分化率則降到7.5%。當Kana濃度達到125 mg/L時，愈傷組織死亡率進一步升高，而愈傷組織再分化已經完全被抑制。由此可見，100～125 mg/L 的Kana可作為刺槐遺傳轉化形成層愈傷組織篩選較適宜的濃度。

2.2.2 Kana對刺槐瓶苗生根的影響刺槐瓶苗生根對Kana反應較敏感（表3），隨著Kana濃度增大，瓶苗生根率迅速降低。在不添加抗生素的培養基中，瓶苗生根率為100%（圖2g）。當Kana濃度為50 mg/L時，瓶苗生根率降為22.5%，當Kana濃度達到75 mg/L時，瓶苗生根已經完全被抑制，從生根數量上看，隨著Kana濃度升高，瓶苗生根數量逐漸減少。由此可見，在刺槐轉基因植株生根時添加選擇劑75 mg/L即可達到良好的效果。

3 結論與討論

在農桿菌介導的遺傳轉化試驗中，抑菌類抗生素的選擇必須綜合考慮對農桿菌抑制作用和對植物組織生長的影響兩方面因素。目前廣泛使用的抑菌類抗生素有三類，青霉素類（氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素-G等）、頭孢霉素類（頭孢霉唑林鈉、頭孢霉呱酮鈉、頭孢拉定、頭孢霉西林鈉、頭孢霉曲松鈉等）、大環內酯類（紅霉素、白霉素等）[7]。植物對抗生素的敏感程度差別很大，不同物種間、同種植物不同品種間甚至同一株植物的不同部位做外植體時對抗生素敏感程度都不同[9]。有的研究中指出羧芐青霉素等對培養中的外植體有促進作用，因其與生長素2，4-D和NAA等有相似的化學結構[10～13]。本研究中，刺槐形成層為外植體的愈傷組織誘導對Cef、Carb、Amp、E四種抗生素的敏感程度為Amp>Carb>Cef、E，對農桿菌的抑菌作用試驗顯示四種抗生素抑菌效果為Cef>Amp、Carb>E。綜合考慮，刺槐形成層為外植體的遺傳轉化中Cef對外植體的生長抑制作用最小，抑菌效果最好，濃度為200 mg/L時已經能完全抑制農桿菌的生長，因此在后續的遺傳轉化過程中應選Cef作為抑菌劑，侵染后初次使用濃度為200 mg/L，隨繼代次數增加逐漸降低使用濃度直至除去。

選擇劑能夠對轉基因植株進行篩選是通過抗生素抗性基因起作用的。本研究中選用卡那霉素作為選擇劑是因為用于刺槐遺傳轉化的重組質粒具有新霉素磷酸轉移酶（NPT Ⅱ）標記基因。npt Ⅱ基因編碼的產物氨基糖苷磷酸轉移酶（APH（3/）Ⅱ-酶）能對氨基糖苷類抗生素具有抗性[14]。Kana能夠與非轉基因植物細胞內線粒體和葉綠體結合而毒害植物綠色器官使其黃化死亡[15]。Kana濃度過高會很快殺死植物組織甚至對轉基因植株產生毒害作用。不同受體材料對選擇劑敏感程度不同[16，17]，相同材料不同培養階段對選擇劑的敏感程度也有差異。因此在遺傳轉化之前需要設計試驗確定受體材料對選擇劑的敏感性。本研究中，刺槐形成層愈傷組織分化過程中添加Kana濃度為100～125 mg/L能起到良好的篩選作用，生根培養時添加Kana 75 mg/L能完全抑制不定根的產生。

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