蘋果TCP轉錄因子家族生物信息學分析

張士剛

摘要：TCP蛋白家族是一類植物特有的轉錄因子家族，參與多種生理生化過程，具有重要的調控作用。本文利用生物信息學方法對蘋果TCP轉錄因子家族成員、基因分類、基因結構、染色體定位、系統進化關系和結構域序列保守性進行了預測和分析。結果表明，蘋果TCP基因家族包含52個成員，分為3類：Class Ⅰ、ClassⅡ和ClassⅢ；MdTCP蛋白含有115～612個氨基酸，等電點為5.41～10.65；除3號染色體外，其余16條染色體均有MdTCP基因分布，其中5號染色體最多，有7個。

關鍵詞：蘋果；TCP；轉錄因子；全基因組分析

中圖分類號：Q754文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0012-06

TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR1（簡稱TCP）家族是一類植物特有的轉錄因子家族。最早發現的家族成員是玉米TB1（teosinte branched 1）基因，金魚草CYC（cycloidea）基因和水稻PCF1、PCF2基因，這4個基因編碼的蛋白都包含一段由約60個氨基酸組成的保守序列，該保守序列能形成一種非典型的螺旋-環-螺旋結構（non-canonical basic-Helix-Loop-Helix structure）[1，2，3]。根據其代表成員TB1、CYC和PCFs的首字母縮寫，把能夠編碼這段保守氨基酸序列的基因命名為TCP基因，把這段保守的氨基酸序列命名為TCP結構域[2]。TCP結構域中的螺旋-環-螺旋區域（bHLH）含有兩個由保守的親水氨基酸構成的中性螺旋結構和一個負責連接兩個螺旋區域的環結構。在第二個螺旋區域有一個特異的“LXXLL”基序，動物bHLH蛋白的研究結果表明這段基序可以通過調控轉錄的共激活單元結合到核定位蛋白上[4]。TCP家族成員除了含有TCP結構域外，還存在一個保守的R結構域[5]，R結構域并不是所有的TCP轉錄因子共有的，它富含精氨酸、賴氨酸和谷氨酸等極性氨基酸，可以形成一個 親水性的α螺旋[3]。

前人對CYC、TB1、PCFs和其他9條預測的擬南芥和玉米TCP基因進行了進化分析，結果表明，這12個基因可以被分為兩個亞家族，一個包含有CYC和TB1，命名為CYC/TB1亞家族；另一個包括PCFs，命名為PCF亞家族。其中TCP結構域普遍存在于所有的TCP家族成員中，而R結構域則特異存在于CYC/TB1亞家族的一些基因中[3]。對多種菊亞綱植物的TCP基因家族成員之間的進化關系進行聚類分析，表明TCP基因家族在各物種間的多樣化對其形態學上的進化具有重要作用[6]。Yao等通過對擬南芥23個TCP基因及水稻22個TCP基因的進化分析，將TCP家族分為三個亞家族：Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ，同時對其結構域進行了序列比對，并分析了不同基因在不同組織中的表達模式[7]。

TCP家族轉錄因子主要在快速生長的組織或器官中表達，與植物細胞的分化和發育有密切關系。玉米TB1基因影響側生分生組織的生長和發育[1，8，9]；水稻TB1基因被認為是水稻側枝發育的負調控元件[10]；擬南芥TCP16基因對早期花粉的發育有重要作用[11]。擬南芥TCP20基因能夠結合CYCB1的GCCCR元件，具有調控細胞分裂和生長的作用[12]，可與AtTCP9基因對抗性地調控擬南芥葉片發育和茉莉酸代謝過程[13]。研究表明，擬南芥中的5個TCP基因：TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24是microRNA 319a的靶基因，參與調控葉片的形態發生[14]。豆科模式植物百脈根中的LjCYC1和LjCYC3參與調控花分生組織的生長發育過程，另一類豆科植物豌豆中的CYC類TCP基因也參與控制背腹軸向不同類型花瓣的發育[15，16，17]。

2010年8月，Velasco等在Nature Genetics上發表了關于‘金冠蘋果基因組測序工作的文章，標志著蘋果全基因組序列的測定已經完成[18]，這一成果將蘋果生物學研究帶入了嶄新的系統生物學時代，為研究者從全基因組水平對蘋果進行研究奠定了基礎。蘋果RING finger、MAPK和MAPKK、MdWRKY轉錄因子及DREB轉錄因子家族基因已通過生物信息學的方法鑒定出來，并進行了全基因組分析和基因功能預測[19～22]。目前TCP轉錄因子家族的研究主要集中在模式植物擬南芥、水稻和玉米中，蔬菜和果樹尤其是蘋果中的報道還非常少。本文從蘋果全基因組出發，利用生物信息學的方法，鑒定出蘋果全部的TCP轉錄因子，對其家族進化關系及結構域序列保守性進行了系統預測和分析，以期為進一步研究MdTCP基因的作用奠定一定的理論基礎。

1材料與方法

從蘋果功能基因組數據庫（http：//www.appplegene.org/）下載TCP轉錄因子家族序列；從GDR數據庫下載‘金冠蘋果全基因組序列，構建本地Blast數據庫，以擬南芥TCP轉錄因子家族基因序列執行本地Blast（1e-003）搜索[23]；合并兩部分結果，利用Perl程序篩選，去掉重復序列，所得結果再利用PFAM及NCBI-CDD工具進行蛋白結構預測，刪除不含TCP結構域的基因。利用ExPASy Proteomics Server（http：//expasy.org/），對所有TCP基因編碼蛋白進行分子量、等電點預測。

從GDR數據庫下載‘金冠蘋果基因組信息文件（assembly gff3 file），利用Perl程序選取TCP基因的染色體位置信息，并利用MapDraw工具進行染色體定位作圖。

用MUSCLE進行序列比對，選取TCP結構域序列，再利用 MEGA5構建進化樹。進化樹生成算法采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），校驗參數Bootstrap 重復1 000次[24]；基因結構利用生物學軟件Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析獲得；保守性分析則采用DNAMAN生物學軟件進行保守序列比對。

2結果與分析

2.1蘋果TCP轉錄因子家族成員的鑒定

利用生物信息學方法，從蘋果全基因組鑒定得到52個TCP轉錄因子家族成員，根據其系統進化樹分析結果，對其進行了系統編號。MdTCP對應的基因編號、基因組登錄號、編碼序列長度、外顯子數量、蛋白長度、分子量、等電點、所在染色體位置和擬南芥同源基因等特征見表1。由表1可知，MdTCP蛋白長度在115 aa（MdTCP50）～612 aa（MdTCP27）范圍內，等電點在5.41（MdTCP32）～10.65之間（MdTCP3）。如圖1所示，有49個MdTCP基因存在于不同染色體上，其中5號染色體最多，有7個；3號染色體上沒有分布；其余染色體上各有1～5個MdTCP基因分布。另外有3個MdTCP基因MdTCP50、MdTCP51和MdTCP52未發現相應的染色體定位信息。

2.2蘋果TCP轉錄因子家族系統進化及基因結構分析

如圖2所示，MdTCP基因的內含子和外顯子數量表現出了較高的保守性，其中沒有內含子的MdTCP基因有32個，占總數的61.5%；有1個內含子的有9個，占17.3%；有2個內含子的有7個，占13.5%；有3個和5個內含子的MdTCP基因分別有2個，各占3.8%。

圖2蘋果TCP轉錄因子家族系統進化樹和基因結構分析

2.3蘋果與擬南芥TCP轉錄因子家族系統進化及保守結構域分析

進化樹分析（圖3）表明，52個MdTCP轉錄因子可分為ClassⅠ、ClassⅡ和Class Ⅲ三類，分別包括22、4和26個，其中第二類數量較少，這與擬南芥和水稻中的規律是一致的[7]。前人研究表明，擬南芥中有24個TCP家族成員[7，25]，由圖3可知，不同的AtTCP轉錄因子與52個MdTCP轉錄因子有著不同的同源性，例如，AtTCP20與MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47同源性較高，AtTCP9與MdTCP18同源性較高。對預測的52個蘋果TCP轉錄因子蛋白序列進行保守結構域序列比對，結果發現，三類蘋果TCP蛋白中均包含有TCP結構域，即TCP轉錄因子的特征序列——bHLH結構域（圖4）。

3討論與結論

隨著越來越多物種全基因組測序工作的完成，海量的基因組數據、信息擺在我們面前，如何從這些數據中找到我們所需要的部分成為亟待解決的難題。利用生物信息學方法對基因組數據進行分析，研究各個物種間的進化關系和相互間的親緣關系，以及物種內各基因家族成員的進化關系，能夠為后續基因功能的研究提供一定的借鑒。本文利用生物信息學方法，對蘋果基因組中的TCP轉錄因子進行了鑒定與分析。以期為今后研究蘋果TCP轉錄因子的具體生理作用奠定一定的理論基礎。

TCP轉錄因子在植物中分布較廣，各物種間的分布數量存在一定差異。擬南芥TCP轉錄因子家族有24個成員，水稻有22個成員[7，25]，本研究鑒定了52個蘋果TCP家族成員。通過系統進化分析發現，MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47與AtTCP20的同源性較高，MdTCP18與AtTCP9的同源性較高，結合擬南芥研究結果，這些基因可能在蘋果生長發育及代謝過程中起作用；而MdTCP8、MdTCP9、MdTCP10、MdTCP11、MdTCP25和MdTCP49與AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4和AtTCP10的同源性較高，說明它們有可能作為microRNA的靶基因參與蘋果葉片的發育。借鑒擬南芥、水稻及其它物種中TCP轉錄因子在植物生長發育和相關代謝過程中的功能研究，探索MdTCP轉錄因子在蘋果生長發育尤其是葉片和側枝、某些激素代謝過程中的功能及其相互作用機制是今后蘋果相關研究的重點。

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