擬南芥PHOT2基因超表達載體的構建及轉化

喬新榮　趙麗平　孫偉　徐長水

摘要：采用PCR技術擴增擬南芥PHOT2基因編碼序列，并將其轉入pSUPER1300超表達載體中，構建了 pSUPER1300-PHOT2 超表達載體，利用農桿菌介導花序轉化法，轉入擬南芥野生型gl1、phot1突變體中。PCR擴增及 RT-PCR 分析表明，該基因超表達，篩選到了潛在的轉基因株系。

關鍵詞：藍光受體；向光素；超表達

中圖分類號： Q943.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0030-02

收稿日期：2013-06-08

作者簡介：喬新榮（1972—），女，河南新密人，博士，講師，主要從事植物生理及分子生物學研究。E-mail：xinrong806@163.com。光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的藍光受體，PHOT1、PHOT2屬于同一家族，其N端含有2個高度保守的光感受區LOV1（light，oxygen，voltage1）區、LOV2區，每個LOV區都結合一分子的黃素單核苷酸（FMN）作為發色團。C端是Ser/Thr蛋白激酶區，藍光激活多個絲氨酸殘基發生自磷酸化作用[1]。研究發現，PHOT1的第851位絲氨酸殘基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1發揮其生理作用所必需的[2]。PHOT都定位于質膜，但藍光會誘導部分PHOT1向胞質遷移，部分PHOT2移至高爾基體及葉綠體外膜[3-5]。PHOT1、PHOT2調節植物的許多生理反應，包括植物的向光反應、氣孔開放、葉綠體遷移及提高弱光下植物的光合作用、降低強光對植物傷害等[1，6]。目前，學者們對PHOT1、PHOT2的結構及其生理作用有了較為深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光強依賴方式共同介導植物的許多生理反應，如共同介導弱光下葉綠體的聚集運動及強光下下胚軸的向光彎曲[7]。為了進一步研究PHOT2基因的功能及該基因下游的信號調控網絡，本研究通過基因重組技術，構建pSUPER1300-PHOT2超表達載體，轉入野生型gl1及phot1突變體2種遺傳背景材料，獲得PHOT2超表達轉基因植株，旨在為深入研究PHOT1、PHOT2所調控的信號網絡提供遺傳材料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料擬南芥野生型gl1（Col-0生態型）、phot1突變體。

1.1.2試劑、菌株、載體大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株GV3101、超表達載體pSUPER1300、TaqDNA聚合酶為筆者所在實驗室保存；克隆載體pMD18-T 、限制性內切酶、Oligo（dT）引物、核酸分子量標準（marker）、DNA凝膠純化回收試劑盒及質粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自 Invitrogen 公司；高效連接試劑盒Soultion I、M-MLV反轉錄酶、潮霉素B（hygromycin B）購自Promega公司；KOD-plus DNA 聚合酶購自ToYoBo公司；各類抗生素購自Solarbio公司；dNTP、普通PCR buffer購自天根生化科技有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司（以下簡稱上海生工）合成（表1）。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成將野生型gl1種子點播于0.6% MS固體培養基上，取生長2周左右的無菌苗0.1 g，液氮研磨，按照Trizol試劑說明書提取總RNA 。將提取的總RNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。以合格的總RNA 為模板，參照M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄，合成cDNA 第一鏈，立即使用或-20 ℃保存備用。

1.2.2AtPHOT2超表達載體構建根據TAIR網站上提供的AtPHOT1的CDS序列及pSUPER1300載體上的多克隆位點，選擇XbaⅠ、KpnⅠ限制性內切酶，設計克隆引物PF1、PR1。以cDNA為模板，利用普通TaqDNA聚合酶預擴增預期片段，再用高保真酶KOD-PlusDNA聚合酶擴增回收。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃復性40 s，68 ℃ 延伸3 min，30個循環；68 ℃延伸10 min。依據TA克隆試劑盒說明書將上述PCR 產物克隆到pMD18-T Vector，然后通過熱激法將連接產物傳入大腸桿菌DH5α中，并在含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB培養基上選擇培養。菌落PCR、質粒PCR后，得到重組克隆pMD18-PHOT2質粒，送上海生工測序。以測序正確的pMD18-PHOT2質粒為模板，按上述引物、PCR程序再進行PHOT2片段擴增，回收片段、pSUPER1300 空質粒分別利用XbaⅠ、KpnⅠ酶切，連接并轉化，進行PCR檢測、酶切鑒定，送上海生工測序，得到pSUPER1300-PHOT2超表達質粒。

1.2.3農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化采用CaCl2凍融法將0.5 μL重組質粒pSUPER13000-PHOT2導入農桿菌GV3101感受態細胞，涂板篩選，挑選單菌落搖菌，以所搖農桿菌菌液為模板，PCR擴增檢測陽性目的質粒。擬南芥轉化采用的方法是花序浸染法[9]，將含有陽性超表達質粒的農桿菌菌液分別浸染野生型gl1、phot1突變體的花序，收獲轉化后的種子，用潮霉素B（Hyg B）進行抗性篩選，得T1代轉基因植株，用SDS法提取葉片DNA，利用PF2、PR2引物擴增PHOT2基因，對能擴增出目的條帶的株系繼續進行Hyg B抗性篩選，直至T3代產生純合株系。

1.2.4表達量鑒定把PHOT2基因轉入gl1背景的株系命名為PHOT2-OX，將以phot1突變體為背景的PHOT2超表達株系命名為phot1PHOT2-OX。用Trizol法提取擬南芥gl1、phot1及上述2個轉基因株系幼苗的總RNA，利用ACTIN2基因做內參，用PF2、PR2引物對對轉基因植株進行PHOT2表達量的半定量PCR鑒定。

2結果與分析

2.1PHOT1基因超表達載體的構建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉錄的cDNA為模板，擴增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長（圖1）。由于該基因CDS片段較長，PCR不易擴增，為了保證載體構建時有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。通過菌落PCR、質粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質粒測序，序列比對完全正確，可用于表達載體構建的模板。用測序正確的質粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。菌落PCR驗證正確后，挑單菌落進行過夜液體培養，提取質粒，質粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質粒送公司測序，經序列比對，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達轉基因植株的初步鑒定

將測序正確的pSUPER1300-PHOT2質粒轉入農桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉基因株系。取部分T3代純合株系生長2～3周的葉片，提取基因組DNA進行初步篩選鑒定，設計PHOT2引物PF2、PR2進行PCR檢測（圖3），檢測了5株PHOT2轉入野生型gl1所獲得的轉基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號泳道，除5號株系有微弱條帶外，其余均擴增出了較亮的電泳條帶，與預期條帶一致。6～11號是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號株系沒有目的條帶，其他5個株系檢測到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達轉基因植株表達量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉基因單株的總RNA，同時提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對照。反轉錄為cDNA，進行半定量RT-PCR鑒定，檢測各個株系PHOT2的表達情況。以ACTIN2為內參，設計表1所示的AF1、AR1為對照引物，PHOT2半定量表達引物為PF2、PR2，進行電泳檢測（圖4）。PHOT2-OX轉基因株系2、3表達量明顯高于對照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號表達量顯著高于對照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉基因植株。

3結論與討論

光不僅是植物生長發育的能量來源，而且也是一種重要的信號分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導了植物的許多生理反應，又有其獨特的功能。本研究利用優化的PCR反應體系擴增擬南芥PHOT2基因，結果表明，該基因CDS序列全長為2 748 bp，與已發表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達載體pSUPER1300中的35S啟動子下游，成功構建了超表達質粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達遺傳材料。

參考文獻：

[1]Christie J M. Phototropin blue-light receptors[J]. Annual Review of Plant Biology，2007，58：21-45.

[2]Inoue S，Kinoshita T，Matsumoto M，et al. Blue light-induced autophosphorylation of phototropin is a primary step for signaling[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（14）：5626-5631.

[3]Kong S G，Kinoshita T，Shimazaki K，et al. The C-terminal kinase fragment of Arabidopsis phototropin 2 triggers constitutive phototropin responses[J]. Plant Journal，2007，51（5）：862-873.

[4]Kong S G，Suetsugu N，Kikuchi S，et al. Both phototropin 1 and 2 localize on the chloroplast outer membrane with distinct localization activity[J]. Plant & Cell Physiology，2013，54（1）：80-92.

[5]Kong S G，Suzuki T，Tamura K，et al. Blue light-induced association of phototropin 2 with the Golgi apparatus[J]. Plant Journal，2006，45（6）：994-1005.

[6]Takemiya A，Inoue S，Doi M，et al. Phototropins promote plant growth in response to blue light in low light environments[J]. Plant Cell，2005，17（4）：1120-1127.

[7]Sakai T，Kagawa T，Kasahara M，et al. Arabidopsis nph1 and npl1：blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6969-6974.

[8]Kagawa T，Sakai T，Suetsugu N，et al. Arabidopsis NPL1：a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science，2001，291（5511）：2138-2141.

[9]Clough S J，Bent A F. Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.趙會彥，肖麓，杜德志. 青海大黃油菜黃籽基因SSR標記開發和圖譜構建[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：32-35.

2結果與分析

2.1PHOT1基因超表達載體的構建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉錄的cDNA為模板，擴增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長（圖1）。由于該基因CDS片段較長，PCR不易擴增，為了保證載體構建時有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。通過菌落PCR、質粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質粒測序，序列比對完全正確，可用于表達載體構建的模板。用測序正確的質粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。菌落PCR驗證正確后，挑單菌落進行過夜液體培養，提取質粒，質粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質粒送公司測序，經序列比對，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達轉基因植株的初步鑒定

將測序正確的pSUPER1300-PHOT2質粒轉入農桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉基因株系。取部分T3代純合株系生長2～3周的葉片，提取基因組DNA進行初步篩選鑒定，設計PHOT2引物PF2、PR2進行PCR檢測（圖3），檢測了5株PHOT2轉入野生型gl1所獲得的轉基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號泳道，除5號株系有微弱條帶外，其余均擴增出了較亮的電泳條帶，與預期條帶一致。6～11號是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號株系沒有目的條帶，其他5個株系檢測到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達轉基因植株表達量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉基因單株的總RNA，同時提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對照。反轉錄為cDNA，進行半定量RT-PCR鑒定，檢測各個株系PHOT2的表達情況。以ACTIN2為內參，設計表1所示的AF1、AR1為對照引物，PHOT2半定量表達引物為PF2、PR2，進行電泳檢測（圖4）。PHOT2-OX轉基因株系2、3表達量明顯高于對照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號表達量顯著高于對照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉基因植株。

3結論與討論

光不僅是植物生長發育的能量來源，而且也是一種重要的信號分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導了植物的許多生理反應，又有其獨特的功能。本研究利用優化的PCR反應體系擴增擬南芥PHOT2基因，結果表明，該基因CDS序列全長為2 748 bp，與已發表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達載體pSUPER1300中的35S啟動子下游，成功構建了超表達質粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達遺傳材料。

參考文獻：

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[4]Kong S G，Suetsugu N，Kikuchi S，et al. Both phototropin 1 and 2 localize on the chloroplast outer membrane with distinct localization activity[J]. Plant & Cell Physiology，2013，54（1）：80-92.

[5]Kong S G，Suzuki T，Tamura K，et al. Blue light-induced association of phototropin 2 with the Golgi apparatus[J]. Plant Journal，2006，45（6）：994-1005.

[6]Takemiya A，Inoue S，Doi M，et al. Phototropins promote plant growth in response to blue light in low light environments[J]. Plant Cell，2005，17（4）：1120-1127.

[7]Sakai T，Kagawa T，Kasahara M，et al. Arabidopsis nph1 and npl1：blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6969-6974.

[8]Kagawa T，Sakai T，Suetsugu N，et al. Arabidopsis NPL1：a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science，2001，291（5511）：2138-2141.

[9]Clough S J，Bent A F. Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.趙會彥，肖麓，杜德志. 青海大黃油菜黃籽基因SSR標記開發和圖譜構建[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：32-35.

2結果與分析

2.1PHOT1基因超表達載體的構建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉錄的cDNA為模板，擴增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長（圖1）。由于該基因CDS片段較長，PCR不易擴增，為了保證載體構建時有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。通過菌落PCR、質粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質粒測序，序列比對完全正確，可用于表達載體構建的模板。用測序正確的質粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養。菌落PCR驗證正確后，挑單菌落進行過夜液體培養，提取質粒，質粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質粒送公司測序，經序列比對，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達轉基因植株的初步鑒定

將測序正確的pSUPER1300-PHOT2質粒轉入農桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉基因株系。取部分T3代純合株系生長2～3周的葉片，提取基因組DNA進行初步篩選鑒定，設計PHOT2引物PF2、PR2進行PCR檢測（圖3），檢測了5株PHOT2轉入野生型gl1所獲得的轉基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號泳道，除5號株系有微弱條帶外，其余均擴增出了較亮的電泳條帶，與預期條帶一致。6～11號是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號株系沒有目的條帶，其他5個株系檢測到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達轉基因植株表達量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉基因單株的總RNA，同時提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對照。反轉錄為cDNA，進行半定量RT-PCR鑒定，檢測各個株系PHOT2的表達情況。以ACTIN2為內參，設計表1所示的AF1、AR1為對照引物，PHOT2半定量表達引物為PF2、PR2，進行電泳檢測（圖4）。PHOT2-OX轉基因株系2、3表達量明顯高于對照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號表達量顯著高于對照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉基因植株。

3結論與討論

光不僅是植物生長發育的能量來源，而且也是一種重要的信號分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導了植物的許多生理反應，又有其獨特的功能。本研究利用優化的PCR反應體系擴增擬南芥PHOT2基因，結果表明，該基因CDS序列全長為2 748 bp，與已發表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達載體pSUPER1300中的35S啟動子下游，成功構建了超表達質粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達遺傳材料。

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[4]Kong S G，Suetsugu N，Kikuchi S，et al. Both phototropin 1 and 2 localize on the chloroplast outer membrane with distinct localization activity[J]. Plant & Cell Physiology，2013，54（1）：80-92.

[5]Kong S G，Suzuki T，Tamura K，et al. Blue light-induced association of phototropin 2 with the Golgi apparatus[J]. Plant Journal，2006，45（6）：994-1005.

[6]Takemiya A，Inoue S，Doi M，et al. Phototropins promote plant growth in response to blue light in low light environments[J]. Plant Cell，2005，17（4）：1120-1127.

[7]Sakai T，Kagawa T，Kasahara M，et al. Arabidopsis nph1 and npl1：blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6969-6974.

[8]Kagawa T，Sakai T，Suetsugu N，et al. Arabidopsis NPL1：a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science，2001，291（5511）：2138-2141.

[9]Clough S J，Bent A F. Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.趙會彥，肖麓，杜德志. 青海大黃油菜黃籽基因SSR標記開發和圖譜構建[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：32-35.