青花菜早中熟種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP標(biāo)記分析

荊贊革　裴徐梨　唐征　張小玲　羅天寬　劉慶　朱世楊

摘要：采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)12份青花菜早中熟種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。從48個(gè)引物組合中篩選得到28對(duì)多態(tài)性較好的引物組合，共檢測到312條擴(kuò)增條帶，每個(gè)引物組合產(chǎn)生2至22個(gè)不等的條帶，其中多態(tài)性片段為227條，多態(tài)性比例為75.76%，揭示所選青花菜種質(zhì)資源間具有較為豐富的遺傳多樣性。相似系數(shù)分析表明種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)為0.650 6～0.878 2，平均為0.786 2。聚類分析結(jié)果顯示熟性和來源可作為青花菜早中熟種質(zhì)聚類的重要農(nóng)藝性狀之一。

關(guān)鍵詞：青花菜；遺傳多樣性；SRAP；早中熟種質(zhì)

中圖分類號(hào)：S635.303文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0041-03

收稿日期：2013-06-04

基金項(xiàng)目：浙江省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：2010C12004）；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：2012C12903-3-3）；浙江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：LY12C15009）；浙江省溫州市科技項(xiàng)目（編號(hào)：N20090016）。

作者簡介：荊贊革（1983—），男，河南三門峽人，博士研究生，助理研究員，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)。E-mail：jingzange@aliyun.com。

通信作者：唐征，碩士，副教授，主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)研究。Tel：（0577）88431228；E-mail：tzeng05@163.com。青花菜（Brassica oleracea var. italica）屬十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種變種，別稱西蘭花、綠花菜、綠菜花等，是我國重要的蔬菜作物之一。它營養(yǎng)全面，含有豐富的維生素C和抗癌物質(zhì)芥子油苷，深受消費(fèi)者喜愛。種質(zhì)資源是作物遺傳改良的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源占有量和研究利用的深度對(duì)育種工作的成效起著至關(guān)重要的作用。因此，深入研究青花菜種質(zhì)資源遺傳多樣性可以較好地幫助育種者了解青花菜的遺傳信息、遺傳結(jié)構(gòu)及種質(zhì)間親緣關(guān)系，有助于對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行有效利用與選擇，從而加速青花菜新品種選育進(jìn)程。SRAP即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism），針對(duì)基因外顯子、內(nèi)含子來設(shè)計(jì)特異引物，因啟動(dòng)子、內(nèi)含子及其間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[1]。該標(biāo)記自2001年提出后，因其成本低、引物通用性強(qiáng)、多態(tài)性高、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，在植物分子育種研究中應(yīng)用廣泛[2]。青花菜在我國的栽培時(shí)間較短，國內(nèi)可供利用的育種材料有限，對(duì)青花菜種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)等方面研究較少，因此筆者對(duì)搜集到的部分青花菜早中熟種質(zhì)資源進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，從DNA水平上揭示其部分遺傳信息和親緣關(guān)系，以期為青花菜早中熟種質(zhì)資源的搜集、鑒定與利用研究提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

以本研究所保存的12份青花菜早中熟種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，進(jìn)行常規(guī)田間管理。材料編號(hào)及相關(guān)信息見表1。

1.2基因組DNA提取

采用改良CTAB法[3]提取幼嫩葉片基因組DNA，經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，稀釋成濃度為15 ng/μL的工作液，超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SRAP擴(kuò)增和電泳檢測

試驗(yàn)選用了4個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物（表2）。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)體系（16 μL）：15 ng

擴(kuò)增產(chǎn)物加入溴酚藍(lán)后，吸取2 μL進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。60 V預(yù)電泳0.5 h，120 V穩(wěn)壓電泳1.5～2.0 h。電泳結(jié)束后用AgNO3進(jìn)行染色：0.5%冰乙酸與10%乙醇混合水溶液固定15 min；2 g/L AgNO3水溶液銀染 10 min；去離子水沖洗3次后，用含12 g/L NaOH、0.6%甲醛、0.02 g/L Na2S2O3的顯色液顯色至條帶清晰后拍照[4]。

1.4數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)電泳檢測結(jié)果并進(jìn)行賦值，樣品同一位置有電泳條帶則賦值為1，無則賦值為0；強(qiáng)帶和弱帶均賦值為1。根據(jù)F值大小按不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法（unweighted pair group method with arithmetic means cluster analysis，UPGMA）進(jìn)行遺傳聚類分析，并繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1青花菜SRAP擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)從48個(gè)SRAP引物組合中，篩選出28個(gè)可穩(wěn)定擴(kuò)增、多態(tài)性較好的擴(kuò)增引物組合。對(duì)12份早中熟青花菜種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，28對(duì)引物組合共檢測到312條清晰擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶為227條，多態(tài)性為75.76%。每對(duì)引物組合擴(kuò)增的等位基因數(shù)差異較大，從2至22個(gè)不等，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增數(shù)為11.14個(gè)，表明所選青花菜種質(zhì)間具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.2青花菜種質(zhì)間的相似系數(shù)和聚類分析

根據(jù)SRAP分析結(jié)果，計(jì)算出12個(gè)青花菜種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（表3）。從表3可以看出，綠玉（4）與綠地（5）、競秀（7）與優(yōu)秀（8）之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.878 2），綠玉（4）與美秀（11）的遺傳相似系數(shù)最小（0.650 6），12個(gè)種質(zhì)間平均相似系數(shù)為0.786 2。

3討論

種質(zhì)資源主要是通過遺傳標(biāo)記多態(tài)性來反映其遺傳多樣性。目前應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記等。其中形態(tài)學(xué)標(biāo)記最簡便易行，標(biāo)記數(shù)量有限，受環(huán)境影響大，很大程度上限制了其應(yīng)用。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記雖不受環(huán)境影響，但仍然存在著標(biāo)記數(shù)量少的缺陷。同工酶標(biāo)記具有共顯性、分析快速、所需材料少等優(yōu)點(diǎn)，但檢測不到點(diǎn)突變和對(duì)酶蛋白電荷性質(zhì)無影響的變異，會(huì)低估遺傳變異[5]。用DNA分子標(biāo)記法比較核苷酸序列的不同，是品種鑒定、遺傳多樣性分析的強(qiáng)有力工具。同其他遺傳標(biāo)記相比，DAN分子標(biāo)記具有巨大的優(yōu)越性[6]。

作為新一代的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建[1]、重要性狀標(biāo)記[20]和作物起源、進(jìn)化及親緣關(guān)系分析等方面都得到了較好的應(yīng)用。

Hale等在2006年已經(jīng)將SRAP標(biāo)記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個(gè)引物組合可檢測到312條擴(kuò)增條帶，平均每個(gè)引物檢測到13條，其中255條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率82%；比本試驗(yàn)平均每個(gè)引物檢測到的條帶數(shù)和多態(tài)性比例略高一些，可能是由選用試驗(yàn)材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗(yàn)所用的28個(gè)SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質(zhì)資源分為2大類群。本研究結(jié)果顯示，青花菜的聚類結(jié)果與其熟性密切相關(guān)，且同一來源的種質(zhì)間具有相對(duì)相近的遺傳基礎(chǔ)，與前人研究結(jié)果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農(nóng)藝性狀之一。

青花菜種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質(zhì)資源的研究提供更加準(zhǔn)確和深入的理論依據(jù)。本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)12份來自不同國家和地區(qū)的的青花菜早中熟種質(zhì)資源在分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，聚類分析結(jié)果可為保存這些種質(zhì)制定正確策略，同時(shí)為青花菜早中熟種質(zhì)資源的遺傳改良和種質(zhì)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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作為新一代的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建[1]、重要性狀標(biāo)記[20]和作物起源、進(jìn)化及親緣關(guān)系分析等方面都得到了較好的應(yīng)用。

Hale等在2006年已經(jīng)將SRAP標(biāo)記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個(gè)引物組合可檢測到312條擴(kuò)增條帶，平均每個(gè)引物檢測到13條，其中255條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率82%；比本試驗(yàn)平均每個(gè)引物檢測到的條帶數(shù)和多態(tài)性比例略高一些，可能是由選用試驗(yàn)材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗(yàn)所用的28個(gè)SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質(zhì)資源分為2大類群。本研究結(jié)果顯示，青花菜的聚類結(jié)果與其熟性密切相關(guān)，且同一來源的種質(zhì)間具有相對(duì)相近的遺傳基礎(chǔ)，與前人研究結(jié)果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農(nóng)藝性狀之一。

青花菜種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質(zhì)資源的研究提供更加準(zhǔn)確和深入的理論依據(jù)。本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)12份來自不同國家和地區(qū)的的青花菜早中熟種質(zhì)資源在分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，聚類分析結(jié)果可為保存這些種質(zhì)制定正確策略，同時(shí)為青花菜早中熟種質(zhì)資源的遺傳改良和種質(zhì)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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作為新一代的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建[1]、重要性狀標(biāo)記[20]和作物起源、進(jìn)化及親緣關(guān)系分析等方面都得到了較好的應(yīng)用。

Hale等在2006年已經(jīng)將SRAP標(biāo)記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個(gè)引物組合可檢測到312條擴(kuò)增條帶，平均每個(gè)引物檢測到13條，其中255條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率82%；比本試驗(yàn)平均每個(gè)引物檢測到的條帶數(shù)和多態(tài)性比例略高一些，可能是由選用試驗(yàn)材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗(yàn)所用的28個(gè)SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質(zhì)資源分為2大類群。本研究結(jié)果顯示，青花菜的聚類結(jié)果與其熟性密切相關(guān)，且同一來源的種質(zhì)間具有相對(duì)相近的遺傳基礎(chǔ)，與前人研究結(jié)果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農(nóng)藝性狀之一。

青花菜種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質(zhì)資源的研究提供更加準(zhǔn)確和深入的理論依據(jù)。本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)12份來自不同國家和地區(qū)的的青花菜早中熟種質(zhì)資源在分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，聚類分析結(jié)果可為保存這些種質(zhì)制定正確策略，同時(shí)為青花菜早中熟種質(zhì)資源的遺傳改良和種質(zhì)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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