青花菜早中熟種質資源遺傳多樣性SRAP標記分析

荊贊革　裴徐梨　唐征　張小玲　羅天寬　劉慶　朱世楊

摘要：采用SRAP分子標記技術對12份青花菜早中熟種質資源進行遺傳多樣性分析。從48個引物組合中篩選得到28對多態性較好的引物組合，共檢測到312條擴增條帶，每個引物組合產生2至22個不等的條帶，其中多態性片段為227條，多態性比例為75.76%，揭示所選青花菜種質資源間具有較為豐富的遺傳多樣性。相似系數分析表明種質間遺傳相似系數為0.650 6～0.878 2，平均為0.786 2。聚類分析結果顯示熟性和來源可作為青花菜早中熟種質聚類的重要農藝性狀之一。

關鍵詞：青花菜；遺傳多樣性；SRAP；早中熟種質

中圖分類號：S635.303文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0041-03

收稿日期：2013-06-04

基金項目：浙江省重大科技專項（編號：2010C12004）；浙江省農業新品種選育重大科技專項（編號：2012C12903-3-3）；浙江省自然科學基金（編號：LY12C15009）；浙江省溫州市科技項目（編號：N20090016）。

作者簡介：荊贊革（1983—），男，河南三門峽人，博士研究生，助理研究員，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。E-mail：jingzange@aliyun.com。

通信作者：唐征，碩士，副教授，主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術研究。Tel：（0577）88431228；E-mail：tzeng05@163.com。青花菜（Brassica oleracea var. italica）屬十字花科蕓苔屬甘藍種變種，別稱西蘭花、綠花菜、綠菜花等，是我國重要的蔬菜作物之一。它營養全面，含有豐富的維生素C和抗癌物質芥子油苷，深受消費者喜愛。種質資源是作物遺傳改良的基礎，種質資源占有量和研究利用的深度對育種工作的成效起著至關重要的作用。因此，深入研究青花菜種質資源遺傳多樣性可以較好地幫助育種者了解青花菜的遺傳信息、遺傳結構及種質間親緣關系，有助于對現有種質資源進行有效利用與選擇，從而加速青花菜新品種選育進程。SRAP即相關序列擴增多態性（sequence related amplified polymorphism），針對基因外顯子、內含子來設計特異引物，因啟動子、內含子及其間隔區長度不同而產生多態性[1]。該標記自2001年提出后，因其成本低、引物通用性強、多態性高、重復性好等諸多優點，在植物分子育種研究中應用廣泛[2]。青花菜在我國的栽培時間較短，國內可供利用的育種材料有限，對青花菜種質資源鑒定評價等方面研究較少，因此筆者對搜集到的部分青花菜早中熟種質資源進行SRAP遺傳多樣性分析，從DNA水平上揭示其部分遺傳信息和親緣關系，以期為青花菜早中熟種質資源的搜集、鑒定與利用研究提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

以本研究所保存的12份青花菜早中熟種質資源為試驗材料，進行常規田間管理。材料編號及相關信息見表1。

1.2基因組DNA提取

采用改良CTAB法[3]提取幼嫩葉片基因組DNA，經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，稀釋成濃度為15 ng/μL的工作液，超低溫冰箱保存備用。

1.3SRAP擴增和電泳檢測

試驗選用了4個正向引物和12個反向引物（表2）。以基因組DNA為模板進行PCR擴增， 反應體系（16 μL）：15 ng

擴增產物加入溴酚藍后，吸取2 μL進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。60 V預電泳0.5 h，120 V穩壓電泳1.5～2.0 h。電泳結束后用AgNO3進行染色：0.5%冰乙酸與10%乙醇混合水溶液固定15 min；2 g/L AgNO3水溶液銀染 10 min；去離子水沖洗3次后，用含12 g/L NaOH、0.6%甲醛、0.02 g/L Na2S2O3的顯色液顯色至條帶清晰后拍照[4]。

1.4數據處理

統計電泳檢測結果并進行賦值，樣品同一位置有電泳條帶則賦值為1，無則賦值為0；強帶和弱帶均賦值為1。根據F值大小按不加權成對群算術平均法（unweighted pair group method with arithmetic means cluster analysis，UPGMA）進行遺傳聚類分析，并繪制親緣關系樹狀圖。

2結果與分析

2.1青花菜SRAP擴增結果

本試驗從48個SRAP引物組合中，篩選出28個可穩定擴增、多態性較好的擴增引物組合。對12份早中熟青花菜種質進行擴增，28對引物組合共檢測到312條清晰擴增條帶，其中多態性條帶為227條，多態性為75.76%。每對引物組合擴增的等位基因數差異較大，從2至22個不等，平均每對引物組合擴增數為11.14個，表明所選青花菜種質間具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.2青花菜種質間的相似系數和聚類分析

根據SRAP分析結果，計算出12個青花菜種質間的遺傳相似系數（表3）。從表3可以看出，綠玉（4）與綠地（5）、競秀（7）與優秀（8）之間的遺傳相似系數最大（0.878 2），綠玉（4）與美秀（11）的遺傳相似系數最小（0.650 6），12個種質間平均相似系數為0.786 2。

3討論

種質資源主要是通過遺傳標記多態性來反映其遺傳多樣性。目前應用較為廣泛的遺傳標記主要有形態學標記、細胞學標記、同工酶標記和DNA分子標記等。其中形態學標記最簡便易行，標記數量有限，受環境影響大，很大程度上限制了其應用。細胞學標記雖不受環境影響，但仍然存在著標記數量少的缺陷。同工酶標記具有共顯性、分析快速、所需材料少等優點，但檢測不到點突變和對酶蛋白電荷性質無影響的變異，會低估遺傳變異[5]。用DNA分子標記法比較核苷酸序列的不同，是品種鑒定、遺傳多樣性分析的強有力工具。同其他遺傳標記相比，DAN分子標記具有巨大的優越性[6]。

作為新一代的SRAP分子標記技術，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質資源鑒定評價、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構建[1]、重要性狀標記[20]和作物起源、進化及親緣關系分析等方面都得到了較好的應用。

Hale等在2006年已經將SRAP標記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個引物組合可檢測到312條擴增條帶，平均每個引物檢測到13條，其中255條為多態性條帶，多態率82%；比本試驗平均每個引物檢測到的條帶數和多態性比例略高一些，可能是由選用試驗材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗所用的28個SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質資源分為2大類群。本研究結果顯示，青花菜的聚類結果與其熟性密切相關，且同一來源的種質間具有相對相近的遺傳基礎，與前人研究結果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農藝性狀之一。

青花菜種質資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質資源的研究提供更加準確和深入的理論依據。本研究利用SRAP標記技術，對12份來自不同國家和地區的的青花菜早中熟種質資源在分子水平上進行遺傳多樣性和親緣關系分析，聚類分析結果可為保存這些種質制定正確策略，同時為青花菜早中熟種質資源的遺傳改良和種質利用提供一定的理論基礎。

參考文獻：

[1]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet，2001，103（8）：455-461.

[2]柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標記——SRAP與TRAP及其應用[J]. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

[3]Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.[J]. Theor Appl Genet，2003，106（3）：461-469.

[4]荊贊革，唐征，張小玲，等. 青花菜SRAP-PCR體系優化與品種分子鑒定[J]. 生物技術通報，2010（12）：122-125.

[5]Fang D Q，Roose M L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers[J]. Theor Appl Genet，1997，95：408-417.

[6]李鴻雁. 扁蓿豆種質資源遺傳多樣性的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

[7]張安世，徐九文，辛長永，等. 河南省水稻中晚粳新品系遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中國農學通報，2010，26（2）：50-54.

[8]趙煒，劉冠明，王曉明，等. 應用SRAP標記分析甜玉米自交系的遺傳差異[J]. 玉米科學，2007，15（增刊）：154-156，159.

[9]文雁成，王漢中，沈金雄，等. 用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎[J]. 中國農業科學，2006，39（2）：246-256.

[10]王華忠，吳則東，王曉武，等. 利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J]. 作物學報，2008，34（1）：37-46.

[11]韓建明，侯喜林，徐海明，等. 不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）種質資源SRAP遺傳分化分析[J]. 作物學報，2007，33（11）：1862-1868.

[12]李嚴，張春慶. 西瓜雜交種遺傳多態性的SRAP標記分析[J]. 園藝學報，2005，32（4）：643-647.

[13]何鳳發，楊志平，張正圣，等. 馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J]. 農業生物技術學報，2007，15（6）：1001-1005.

[14]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等. 蘿卜品種指紋圖譜 SRAP與AFLP分析[J]. 植物研究，2007，27（6）：687-693，714.

[15]李慧芝，尹燕枰，張春慶，等. SRAP在蔥栽培品種遺傳多樣性研究中的適用性分析[J]. 園藝學報，2007，34（4）：929-934.

[16]楊柳燕，徐永陽，徐志紅，等. 甜瓜霜霉病抗性遺傳及SRAP分子標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1200-1202.

[17]張馳，關媛，何歡樂，等. 利用SRAP分子標記對黃瓜Gl基因的初步定位分析[J]. 上海交通大學學報：農業科學版，2009，27（4）：380-383.

[18]吳國平，袁穩，劉金兵，等. 甜椒細胞質雄性不育基因的SRAP標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1114-1118.

[19]周春娥，王芳，周延清，等. 大豆遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：40-42.

[20]雷劍，柳俊. 一個與馬鈴薯青枯病抗性連鎖的SRAP標記篩選[J]. 中國馬鈴薯，2006，20（3）：150-153.

[21]Hale A L，Farnham M W，Menz M A. Use of PCR-based markers for differentiating elite broccoli inbreds[J]. J Amer Soc Hort Sci，2006，131（3）：418-423.

[22]Lu X J，Liu L W，Gong Y Q，et al. Cultivar identification and genetic diversity analysis of broccoli and its related species with RAPD and ISSR markers[J]. Scientia Horticulturae，2009，122（4）：645-648.

[23]孫德嶺，趙前程，宋文芹，等. 花椰菜類蔬菜自交系基因組間親緣關系的AFLP分析[J]. 園藝學報，2002，29（1）：72-74.李樹麗. 培養基中不同因素對中華紅葉楊外植體褐變的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：44-46.

作為新一代的SRAP分子標記技術，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質資源鑒定評價、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構建[1]、重要性狀標記[20]和作物起源、進化及親緣關系分析等方面都得到了較好的應用。

Hale等在2006年已經將SRAP標記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個引物組合可檢測到312條擴增條帶，平均每個引物檢測到13條，其中255條為多態性條帶，多態率82%；比本試驗平均每個引物檢測到的條帶數和多態性比例略高一些，可能是由選用試驗材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗所用的28個SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質資源分為2大類群。本研究結果顯示，青花菜的聚類結果與其熟性密切相關，且同一來源的種質間具有相對相近的遺傳基礎，與前人研究結果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農藝性狀之一。

青花菜種質資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質資源的研究提供更加準確和深入的理論依據。本研究利用SRAP標記技術，對12份來自不同國家和地區的的青花菜早中熟種質資源在分子水平上進行遺傳多樣性和親緣關系分析，聚類分析結果可為保存這些種質制定正確策略，同時為青花菜早中熟種質資源的遺傳改良和種質利用提供一定的理論基礎。

參考文獻：

[1]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet，2001，103（8）：455-461.

[2]柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標記——SRAP與TRAP及其應用[J]. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

[3]Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.[J]. Theor Appl Genet，2003，106（3）：461-469.

[4]荊贊革，唐征，張小玲，等. 青花菜SRAP-PCR體系優化與品種分子鑒定[J]. 生物技術通報，2010（12）：122-125.

[5]Fang D Q，Roose M L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers[J]. Theor Appl Genet，1997，95：408-417.

[6]李鴻雁. 扁蓿豆種質資源遺傳多樣性的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

[7]張安世，徐九文，辛長永，等. 河南省水稻中晚粳新品系遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中國農學通報，2010，26（2）：50-54.

[8]趙煒，劉冠明，王曉明，等. 應用SRAP標記分析甜玉米自交系的遺傳差異[J]. 玉米科學，2007，15（增刊）：154-156，159.

[9]文雁成，王漢中，沈金雄，等. 用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎[J]. 中國農業科學，2006，39（2）：246-256.

[10]王華忠，吳則東，王曉武，等. 利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J]. 作物學報，2008，34（1）：37-46.

[11]韓建明，侯喜林，徐海明，等. 不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）種質資源SRAP遺傳分化分析[J]. 作物學報，2007，33（11）：1862-1868.

[12]李嚴，張春慶. 西瓜雜交種遺傳多態性的SRAP標記分析[J]. 園藝學報，2005，32（4）：643-647.

[13]何鳳發，楊志平，張正圣，等. 馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J]. 農業生物技術學報，2007，15（6）：1001-1005.

[14]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等. 蘿卜品種指紋圖譜 SRAP與AFLP分析[J]. 植物研究，2007，27（6）：687-693，714.

[15]李慧芝，尹燕枰，張春慶，等. SRAP在蔥栽培品種遺傳多樣性研究中的適用性分析[J]. 園藝學報，2007，34（4）：929-934.

[16]楊柳燕，徐永陽，徐志紅，等. 甜瓜霜霉病抗性遺傳及SRAP分子標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1200-1202.

[17]張馳，關媛，何歡樂，等. 利用SRAP分子標記對黃瓜Gl基因的初步定位分析[J]. 上海交通大學學報：農業科學版，2009，27（4）：380-383.

[18]吳國平，袁穩，劉金兵，等. 甜椒細胞質雄性不育基因的SRAP標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1114-1118.

[19]周春娥，王芳，周延清，等. 大豆遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：40-42.

[20]雷劍，柳俊. 一個與馬鈴薯青枯病抗性連鎖的SRAP標記篩選[J]. 中國馬鈴薯，2006，20（3）：150-153.

[21]Hale A L，Farnham M W，Menz M A. Use of PCR-based markers for differentiating elite broccoli inbreds[J]. J Amer Soc Hort Sci，2006，131（3）：418-423.

[22]Lu X J，Liu L W，Gong Y Q，et al. Cultivar identification and genetic diversity analysis of broccoli and its related species with RAPD and ISSR markers[J]. Scientia Horticulturae，2009，122（4）：645-648.

[23]孫德嶺，趙前程，宋文芹，等. 花椰菜類蔬菜自交系基因組間親緣關系的AFLP分析[J]. 園藝學報，2002，29（1）：72-74.李樹麗. 培養基中不同因素對中華紅葉楊外植體褐變的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：44-46.

作為新一代的SRAP分子標記技術，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、馬鈴薯[13]、蘿卜[14]、大蔥[15]、黃瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多種作物的種質資源鑒定評價、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構建[1]、重要性狀標記[20]和作物起源、進化及親緣關系分析等方面都得到了較好的應用。

Hale等在2006年已經將SRAP標記用于青花菜的遺傳多樣性分析[21]，24個引物組合可檢測到312條擴增條帶，平均每個引物檢測到13條，其中255條為多態性條帶，多態率82%；比本試驗平均每個引物檢測到的條帶數和多態性比例略高一些，可能是由選用試驗材料和引物組合的不同所引起。

在聚類分析過程中，試驗所用的28個SRAP引物可將12份青花菜早中熟種質資源分為2大類群。本研究結果顯示，青花菜的聚類結果與其熟性密切相關，且同一來源的種質間具有相對相近的遺傳基礎，與前人研究結果[22-23]相符，即熟性和來源可作為青花菜聚類的重要分類農藝性狀之一。

青花菜種質資源遺傳多樣性SRAP分析可為種質資源的研究提供更加準確和深入的理論依據。本研究利用SRAP標記技術，對12份來自不同國家和地區的的青花菜早中熟種質資源在分子水平上進行遺傳多樣性和親緣關系分析，聚類分析結果可為保存這些種質制定正確策略，同時為青花菜早中熟種質資源的遺傳改良和種質利用提供一定的理論基礎。

參考文獻：

[1]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet，2001，103（8）：455-461.

[2]柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標記——SRAP與TRAP及其應用[J]. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

[3]Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.[J]. Theor Appl Genet，2003，106（3）：461-469.

[4]荊贊革，唐征，張小玲，等. 青花菜SRAP-PCR體系優化與品種分子鑒定[J]. 生物技術通報，2010（12）：122-125.

[5]Fang D Q，Roose M L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers[J]. Theor Appl Genet，1997，95：408-417.

[6]李鴻雁. 扁蓿豆種質資源遺傳多樣性的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

[7]張安世，徐九文，辛長永，等. 河南省水稻中晚粳新品系遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中國農學通報，2010，26（2）：50-54.

[8]趙煒，劉冠明，王曉明，等. 應用SRAP標記分析甜玉米自交系的遺傳差異[J]. 玉米科學，2007，15（增刊）：154-156，159.

[9]文雁成，王漢中，沈金雄，等. 用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎[J]. 中國農業科學，2006，39（2）：246-256.

[10]王華忠，吳則東，王曉武，等. 利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J]. 作物學報，2008，34（1）：37-46.

[11]韓建明，侯喜林，徐海明，等. 不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）種質資源SRAP遺傳分化分析[J]. 作物學報，2007，33（11）：1862-1868.

[12]李嚴，張春慶. 西瓜雜交種遺傳多態性的SRAP標記分析[J]. 園藝學報，2005，32（4）：643-647.

[13]何鳳發，楊志平，張正圣，等. 馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J]. 農業生物技術學報，2007，15（6）：1001-1005.

[14]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等. 蘿卜品種指紋圖譜 SRAP與AFLP分析[J]. 植物研究，2007，27（6）：687-693，714.

[15]李慧芝，尹燕枰，張春慶，等. SRAP在蔥栽培品種遺傳多樣性研究中的適用性分析[J]. 園藝學報，2007，34（4）：929-934.

[16]楊柳燕，徐永陽，徐志紅，等. 甜瓜霜霉病抗性遺傳及SRAP分子標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1200-1202.

[17]張馳，關媛，何歡樂，等. 利用SRAP分子標記對黃瓜Gl基因的初步定位分析[J]. 上海交通大學學報：農業科學版，2009，27（4）：380-383.

[18]吳國平，袁穩，劉金兵，等. 甜椒細胞質雄性不育基因的SRAP標記[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1114-1118.

[19]周春娥，王芳，周延清，等. 大豆遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：40-42.

[20]雷劍，柳俊. 一個與馬鈴薯青枯病抗性連鎖的SRAP標記篩選[J]. 中國馬鈴薯，2006，20（3）：150-153.

[21]Hale A L，Farnham M W，Menz M A. Use of PCR-based markers for differentiating elite broccoli inbreds[J]. J Amer Soc Hort Sci，2006，131（3）：418-423.

[22]Lu X J，Liu L W，Gong Y Q，et al. Cultivar identification and genetic diversity analysis of broccoli and its related species with RAPD and ISSR markers[J]. Scientia Horticulturae，2009，122（4）：645-648.

[23]孫德嶺，趙前程，宋文芹，等. 花椰菜類蔬菜自交系基因組間親緣關系的AFLP分析[J]. 園藝學報，2002，29（1）：72-74.李樹麗. 培養基中不同因素對中華紅葉楊外植體褐變的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：44-46.