小麥散黑穗病病原菌PCR檢測方法的研究

朱桂清　遲文娟　曹遠銀　陳秀梅

摘要：小麥散黑穗病由小麥散黑粉菌引起，是世界各麥區發生的典型種傳病害。近些年來，因缺少簡便有效的種子檢測技術，從而影響其防治的種子處理決策，使該病呈現出加重趨勢。本研究以真菌rDNA非編碼區ITS1、5.8S和ITS2的通用引物，分別對小麥散黑穗病菌等10種相關病菌進行PCR擴增、測序、Genbank搜索，通過Accelrys Gene 25軟件比對，設計以小麥散黑穗病菌為靶標的特異引物，對上述10種病菌進行檢測，唯有靶標病菌呈陽性；經1ng～1fg 7個靶標病菌的DNA濃度靈敏度檢測，表明對其最低檢測限為1pgDNA。本方法檢測小麥散黑穗病快速、準確、靈敏，為實現帶病種子檢測提供了關鍵技術支撐。

關鍵詞：小麥散黑穗病；PCR檢測；種傳病害；特異性引物

中圖分類號：S435.121.4+4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0036-03

收稿日期：2013-05-01

基金項目：國家公益性行業（農業）科研專項（編號：2013016）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAD19B04）。

作者簡介：朱桂清（1959—），女，高級實驗師，主要從事植物病理學研究。E-mail：zhugq1959@126.com。

通訊作者：曹遠銀，研究員，博士，主要從事植物免疫學與分子植物病理學研究。E-mail：caoyy66@yahoo.com.cn。小麥散黑穗病由小麥散黑粉菌[Ustilago tritici （Pers.） Rostr.]引起，各國小麥產區均有發生[1]。在我國以華中和華東麥區發病最重，而東北麥區則重于西北麥區。該病為典型的種傳病害，帶菌種子（胚內菌絲體）是唯一的傳播途徑。小麥單株一經罹病，其產量損失就近100%，換句話說，小麥發病株率可約等于產量損失率。從對整體生產危害情況來看，未見有毀滅性的報道，嚴重地塊可達10%以上，但一般中等發病率田塊僅為1%～5%。然而，近20年來，由于疏于藥劑拌種處理，病情呈上升趨勢。例如，被認為較輕發生的西北天水等地區也變得較普遍，重病田塊發病率竟達15%～200%[2]。在國外的發生情況也呈類似上升，如加拿大西部小麥散黑穗病造成硬粒小麥和面包麥的產量損失更嚴重，已高達27%[3]。

該病的最有效防治手段是種子處理等化學方法，發病后的應急防治意義不大。因此，關于種子處理的各種化學藥劑種類研發較多，但鮮有大規模應用于拌種的報道。其原因應與小麥散黑穗病的防治還未引起足夠重視、種子處理費時費工、增加成本及污染有關，特別是因缺乏簡便快速可靠的技術檢測病種率而影響拌種的決策有關。為了改變這種現狀，研制其簡便可靠的檢測方法是十分必要的。常規檢驗方法非常耗時，完全依賴專業人員的癥狀觀察、篩選培養基進行培養、育苗觀察、血清學等鑒定以及廣博的分類知識，而且其準確性與靈敏度難以滿足要求[4-5]。現代分子生物學方法為種傳病害檢測提供了新的可靠途徑，基于DNA檢測的方法[如雜交探針、常規PCR、PCR-RFLP、巢式PCR、多重PCR、反轉錄PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA、in situ PCR、DNA 印跡、基因芯片以及RAPD（SCAR）、SSR、DNA條紋碼等]快速簡便實用，還能滿足高通量和潛伏期檢測的要求[5-8]。國際上已制定了61種種傳病害不同的標準檢測方法[5-8]，好幾種常見黑穗（粉）病已建立了分子檢測方法，如常規PCR檢測玉米瘤黑粉病[9]、巢式PCR檢測茭白黑粉病和甘蔗黑粉病[10-11]、DNA印跡和PCR檢測與區分玉米絲黑穗病和瘤黑粉病[12]等種傳病害，但對小麥散黑穗病的分子檢測方面，尚未見對該病菌的種特異性強、靈敏度高的經濟、簡便、快速分子檢測方法的報道。本文報道了利用普通PCR檢測小麥散黑穗病的新方法。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1主要儀器與設備移液槍（德國，eppendorf）；DYY-10型三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR基因擴增儀（美國，Bio-Rad）；超純水制造系統（美國，MILLI-Q）；高速冷凍離心機（日本，日立公司）；凝膠成像分析系統（美國，科達公司）；紫外分光光度計U-3010（日立公司）。

1.1.2主要試劑主要化學與生物試劑購自寶生物工程（大連）有限公司與美國Sigma公司，擴增引物與雜交探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3供試菌種供試菌株見表1。小麥條銹菌由中國農業科學院植物保護研究所銹病組提供，其他菌系均由沈陽農業大學提供。

表1供試菌株名稱和代號

病原菌1所致病害1菌系代號大麥散黑粉菌（Ustilago nuda）1小麥散黑穗病1XSH絲孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）1玉米絲黑穗病1YSH小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici）1小麥白粉病1XBF葫蘆科白粉菌（Erysiphe cucurbitacearum）1黃瓜白粉病1HBF條銹病菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici）1小麥條銹病1XTX稈銹病菌（P. graminis f.sp. tritici）1小麥稈銹病1XGX細柄銹病（P. triticina）1小麥葉銹病1XYX禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）1小麥赤霉病1XCM小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）1小麥紋枯病1XWK立枯絲核菌（Rh. solani）1玉米紋枯病1YWK

1.2試驗方法

1.2.1菌種收集方法（1）小麥散黑穗病菌和玉米絲黑穗病菌的收集。用解剖針從樣品或菌癭中挑取單個冬孢子置于2%瓊脂平板上，于20 ℃、12 h光照條件下培養15～20 d，顯微鏡下觀察有無孢子萌發，將萌發孢子轉移至PDA平板上，20 ℃培養15 d，收集菌絲，4 ℃保存備用。（2）小麥白粉病菌的收集。在實驗室內，將保存的白粉病菌單菌落用抖落法接種到高感品種小麥穗上，培養7～14 d，待菌落長出，分生孢子大量繁殖時，在超凈工作臺上搖動花盆將其抖落到載玻片上，再用細毛筆將其刷進1.5 mL離心管中（可多次收集，每支管中達到30～50 mg孢子），將收集了孢子的離心管置于裝有變色硅膠的干燥器中干燥3～5 d，-20 ℃保存備用。 （3）小麥稈銹病菌、小麥葉銹病菌的收集。將感病品種McNair701播種于花盆內，待幼苗長至2葉1心時剪取第1張葉，平展于鋪有雙層濾紙的培養皿內（葉背面朝上），培養皿中墊有浸過保鮮液的濾紙。用牙簽沾上孢子，輕輕地向葉面涂抹，使葉面均勻地沾有1層孢子。接種后，用5×10-4Tween 20溶液進行噴霧，18 ℃ 黑暗條件下保濕6～18 h。18 ℃、8 000 lx光照 14 h/d，培養15 d左右，收集孢子，干燥，-20 ℃保存備用。（4）其他參考菌株的收集。將在PDA培養基上培養4 d的各菌株接入馬鈴薯液體培養基中，振蕩培養（25 ℃，100 r/min） 4～7 d，用無菌紗布過濾，再用無菌水沖洗2次，用濾紙吸干多余水分，將菌絲體放入65 ℃恒溫箱中干燥2～4 h，取出碾碎，裝入 1.5 mL 離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存備用[13]。

1.2.2基因組DNA的提取小麥散黑穗菌、玉米絲黑穗菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、玉米紋枯菌等分離純化后接種至PD培養基中培養，菌絲體經真空抽濾，采用Pascual等改良后的CTAB法[14]提取病菌DNA。小麥白粉菌、黃瓜白粉菌、小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌的小種或菌株在溫室用各自的高感品種繁殖，分別收取孢子，采用Enjalbert等玻璃珠破碎病菌細胞壁的CTAB法[15]提取DNA，其中幾個特別環節分述如下：（1）小麥白粉菌DNA的提取。隔離條件下收集白粉菌至2 mL離心管中，將菌體重量按5 mL ∶1 g比例加入裂解緩沖液，加入3/10總體積的石英砂，蓋緊，渦旋振蕩5～ 8 min，65 ℃ 水浴10 min，加入600 μL 7.5 mol/L NH4Ac，冰浴 8 min；然后反復抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（2）黃瓜白粉病菌提取。參照王娜等的方法[16]，用手指輕彈染病的葉片，使病菌孢子及菌絲落在滴加緩沖液的載玻片上，在解剖鏡下用針將孢子和菌絲壓碎后轉移至離心管，加入 10 μL Tween20，60 ℃水浴3 h后，12 000 r/min離心 5 min，取上清液，-20 ℃保存，待用。（3）小麥條銹病菌、小麥稈銹病菌、小麥葉銹病菌DNA的提取。稱取小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌孢子裝于2 mL離心管中，加入玻璃珠及預熱的0.8%CTAB提取緩沖液混勻，在渦旋儀上以最大速度振蕩 3 min 后，于 65 ℃ 條件下水浴 1.5 h，然后反復抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（4）其他菌株DAN的提取。用液氮將病原菌快速研磨后轉入事先裝有500 μL提取緩沖液A的2 mL離心管中，混勻后加入50 μL 10%SDS，混勻，置于水浴鍋 37 ℃ 1 h；再加入 75 mL 5 mol/L NaCl及65 μL 10%CTAB，再次混勻，置于 65 ℃ 水浴鍋20 min；然后反復抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。

1.2.3專化性引物的設計選用擴增ITS1、5.8S、ITS2核糖體基因的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），專一擴增 rDNA 中的ITS1、5.8S、ITS2區域[17]。對得到的PCR產物，進行測序，用測序結果登錄Genebank，與相關菌的ITS序列進行比對，選取小麥散黑穗病菌的特異DNA序列做特異的PCR引物（圖1）。

1.2.4PCR擴增PCR反應體系（20 μL）：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl2 1.5 μL；10 mmol/L dNTP 0.4 μL；引物（15 μmol/L） 各0.8 μL；Taq DNA聚合酶（5 U） 0.2 μL；DNA模板（1ng/ μL） 1.0 μL；ddH2O 14.1 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.5PCR產物電泳與染色觀察PCR擴增完畢后，用 1×TBE 配制1%瓊脂糖凝膠進行電泳，每孔加樣5 μL，100 bp Ladder Marker為對照，電泳液為1×TBE。凝膠在 0.5 μg/mL 溴乙錠溶液染色20 min，凝膠成像分析系統照相。

1.2.6小麥散黑穗病菌PCR引物特異性檢測用設計合成的特異性引物對所有供試菌株及小麥葉片的DNA進行PCR擴增，檢測設計引物的特異性。

1.2.7小麥散黑穗病菌PCR引物靈敏性檢測將提取的小麥散黑穗病菌的DNA稀釋成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7個不同濃度，用設計的引物進行PCR擴增，根據凝膠電泳結果測定引物的靈敏度。

2結果與分析

2.1小麥病害病原菌PCR引物設計結果

將小麥散黑穗病菌的ITS區域測序結果與Genebank中登錄的相關菌的ITS序列進行比對，設計小麥散黑穗病菌的特異性引物，比對結果及特異性引物如圖1所示，即設計出小麥散黑穗病菌的PCR的特異擴增引物對XSHF（5′-AGGAGAAAATCCTCGCGTCT-3′）/XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′）。F和R引物的序列長度均為20個堿基，很理想。

2.2小麥散黑穗病菌特異性檢測

以設計的小麥散黑穗病菌特異性引物XSHF/R對所有供試菌株的DNA進行PCR擴增，只有小麥散黑穗病菌能擴增出533 bp左右的條帶，其他供試非靶標參考菌株未擴增出條帶，說明設計的引物對小麥散黑穗病菌具有特異性，結果見圖1。

2.3小麥散黑穗病菌檢測靈敏度測定

用引物XSHF/R對稀釋成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7個不同濃度的小麥散黑穗病菌DNA進行PCR擴增，結果可以檢測到最低含量為1 pg的DNA（圖2）。

3結論與討論

小麥散黑穗病是小麥常見的典型種傳病害，帶菌種子的病菌來源于生長季小麥揚花時，其他病穗上的冬孢子經風雨傳給健康的花柱頭，孢子萌發侵入子房，再以休眠菌絲潛伏在胚內。種子萌發時，病菌被激活生長且始終位于植株頂端和穗原基，直到抽穗，顯露最易識別的癥狀：薄膜包裹的冬孢子團（病穗）[18-19]。帶菌種子或植株與無菌種子或植株外觀均無可診斷的差異，因此，是否需要進行化學藥劑拌種等防治處理的決策需要以帶菌率檢測作為科學依據。快速、簡便、準確、可靠的檢測方法是實現這一目標的可靠保證。本研究利用真菌通用引物[18]，對小麥散黑穗病菌的ITS區域序列進行PCR擴增、測序、Genbank搜索，用其他9個相近病菌作參照，通過軟件分析比對，設計了長度為20個堿基的該病菌的特異性引物XSHF（5′-AGGAGAAA ATCCTCGCGTCT-3′）/ XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′），能在Ustilago屬內種的水平特異性上檢測小麥散黑穗病菌，對小麥散黑穗病菌的檢測限為1 pg。該方法快速、準確、靈敏，為實現該病種子帶菌率檢測提供了關鍵技術支撐。