不同因素對中華卷柏愈傷組織誘導的影響

付偉　葉嘉　張浩　紀光思

摘要：以中華卷柏為試驗材料，比較不同外植體、不同光照條件、不同激素組合對愈傷組織誘導率的影響。結果表明：（1）莖尖是誘導中華卷柏愈傷組織的最佳外植體；（2）黑暗培養能夠明顯促進愈傷組織的發生；（3）莖尖在 1/2MS+6-BA 0. 5 mg/L+2，4-D 2 mg/L的培養基中誘導率最高，達55.6%。同時研究了不同繼代時間對愈傷組織褐化的影響，結果表明：25 d繼代1次可使褐化率降至33.3%。

關鍵詞：中華卷柏；愈傷組織；誘導

中圖分類號： S567.23+9.043文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0039-02

收稿日期：2013-08-12

基金項目：河北省科技支撐計劃（編號：06220111D-1）；邯鄲市科學技術研究與發展計劃（編號：1223109092-10）。

作者簡介：付偉（1978—），女，碩士，講師，主要研究方向為植物生物技術。E-mail：fwximei@126.com。

通信作者：葉嘉，碩士，教授，從事資源植物開發和利用。E-mail：yejia630819@126.com。中華卷柏[Selaginella sinensis （Desv.） Spring]為卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬多年生草本植物，別稱地柏枝，主要分布于我國東北、華北等溫帶地區，是我國特有的藥用植物。中華卷柏含有穗花杉雙黃酮、羅伯斯特杉雙黃酮、銀杏雙黃酮等多種雙黃酮類化合物[1-2]。其全草為民間常用草藥，有清熱利尿、解毒散寒、消炎止血的功效，用于肝炎、膽囊炎、慢性氣管炎、慢性腎炎、濕疹、燒傷燙傷等的治療[3]。目前對中華卷柏的研究多集中在孢子形態學[4-5]、化學成分研究[5-6]、藥用價值[7-9]等方面。迄今在國內未見有關中華卷柏愈傷組織誘導的報道。愈傷組織誘導是植物生物反應器規模化生產植物次生代謝產物的重要環節[10]。通過中華卷柏愈傷組織的誘導，可以為利用生物反應器生產中華卷柏黃酮類化合物開辟有效途徑。本試驗以中華卷柏不同外植體為試驗材料，探討外植體種類、光照、植物生長調節劑、繼代時間對愈傷組織的影響，以期為中華卷柏懸浮細胞的培養、誘變、次生代謝產物的生產奠定一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料的滅菌及外植體的制備

供試材料采自河北省武安國家森林公園，栽植于邯鄲學院生物科學系溫室內。選取中華卷柏的莖尖、帶葉莖段、幼葉片作為外植體材料。

1.2試驗方法

1.2.1外植體對愈傷組織誘導的影響接種前先用洗潔精將外植體表面清洗干凈，自來水流動沖洗30 min。然后在超凈工作臺內用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗4次，然后用0.1%的HgCl2消毒5 min，用無菌水洗滌6次，每次3 min，用無菌吸水紙吸干水分。將莖尖和帶葉莖段切成0.5～1 cm，剪下單葉，備用。將消毒好的外植體接種在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%脂瓊+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L 的培養基上。每個處理接種24個外植體，重復3次，30 d后統計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的外植體塊數/接種的外植體塊數×100%。

1.2.2光照條件對愈傷組織誘導的影響將消毒好的莖尖接種在上述培養基中，培養條件分別為A：光照強度1 500 lx，光照時長12 h/d，溫度為 （25±1） ℃；B：暗培養，溫度為 （25±1） ℃。每個處理接種60個外植體，20 d后統計愈傷組織誘導情況。

1.2.3植物激素組合對愈傷組織誘導的影響將消毒好的莖尖接種在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂并附加不同濃度的2，4-D和6-BA的愈傷組織誘導培養基上，暗培養于 （25±1） ℃ 的條件下。每個處理接種24個外植體，重復3次，30 d后統計愈傷組織生長情況。

1.2.4繼代培養時間對愈傷組織褐化的影響將培養不同時間的愈傷組織切下接種到1/2MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2 mg/L 的培養基上。每個處理接種30個愈傷組織，重復3次，75 d后觀察愈傷組織生長及褐化情況。

1.3數據統計

試驗數據采用Excel 2003和DPS 軟件對愈傷組織誘導培養結果進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同外植體對愈傷組織誘導的影響

在相同培養條件下，中華卷柏不同部位作為外植體愈傷組織的誘導率不同，且差異顯著（表1）。莖尖比較容易形成愈傷組織，出愈時間較早，培養15 d即產生愈傷組織，形成的愈傷組織呈淺黃色、光滑、半透明，莖尖出愈率最高達23.6%。帶葉莖段愈傷組織誘導效果相對較差，出愈時間較晚，比莖尖出愈時間延長1/3，出愈率也較低，為97%。幼葉的誘導效果最差，在培養30 d后全部枯萎死亡，未發現愈傷組織萌動。因此莖尖是中華卷柏愈傷組織誘導最適宜的外植體。

2.2光照對愈傷組織誘導的影響

光照條件對愈傷組織誘導的影響較大（表2）。暗培養更

表1不同外植體對愈傷組織誘導的影響

外植體類型1出愈時間（d）1誘導率（%）莖尖115123.6a帶葉莖段12019.7b幼葉1—10c注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

有利于卷柏愈傷組織的形成，相對于光培養，愈傷組織誘導率提高了13.3百分點。愈傷組織形成的時間也有所提前，在誘導愈傷組織的培養基上暗培養6 d后，莖尖開始增厚膨大，11 d 后在莖尖處產生淺黃色愈傷組織（圖1-A）。

2.3不同激素濃度對愈傷組織誘導的影響

由表3可知，當6-BA濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高達55.6%；當6-BA為0.1 mg/L，沒有誘導出愈傷組織。可見6-BA的濃度是誘導愈傷組織的關鍵。在一定范圍內（0.1～0.5 mg/L），隨著6-BA濃度的增高，中華卷柏愈傷組織的誘導率也相應提高；但超過其臨界濃度后，誘導率隨之下降。在6-BA使用濃度相同時，2.0 mg/L的 2，4-D 比1.5 mg/L的2，4-D更有利于愈傷組織誘導率的提高。不同濃度配比的6-BA和2，4-D對中華卷柏愈傷組織形成時間影響不大，基本出現在11～13 d，形成的愈傷組織顏色以淡黃色為主（圖1-A）。誘導愈傷組織的最佳培養基為1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，該條件下愈傷組織的誘導率最高，達55.6%。

2.4不同繼代時間對愈傷組織褐化的影響

試驗結果表明，不同繼代時間對愈傷組織生長情況有明顯影響，繼代時間過多或過長均不利于愈傷組織的生長（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長較慢且72.2%出現褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長較快，由淺黃色變為淺黃綠色，表面呈現油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長的繼代時間會使酚類物質的氧化產物擴散到培養基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時間對于愈傷組織褐化的影響

繼代時間

（d）1愈傷組織生長情況1褐化率

（%）151生長較慢172.2b251生長快131.1c351幾乎不生長1100.0a

3討論

本試驗分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導愈傷組織，發現外植體類型對能否誘導出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養效果最好，誘導率最高，這與王晶等[8]的研究結果一致。以幼葉為外植體沒有誘導出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現的創傷面會引起酚類等次生代謝物質的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結果相吻合[11-12]。

光照對植物胚性愈傷組織誘導的影響因物種而異。本研究發現，在暗培養條件下，中華卷柏愈傷組織誘導階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調節控制下進行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗表明，誘導率因培養基中激素的配比不同而表現出不同，并且6-BA對愈傷組織的形成起著關鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導率。在試驗范圍內，以中華卷柏莖尖為外植體誘導培養基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

參考文獻：

[1]Zhang L P，Liang Y M，Wei X C，et al. A new unusual natural pigment from Selaginella sinensis and its noticeable physicochemical properties[J]. The Journal of Organic Chemistry， 2007， 72（10）： 3921-3924.

[2]Ma S C，But P P，Ooi V E，et al. Antiviral amentoflavone from Selaginella sinensis[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2001， 24（3）： 311-312.

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[8]張紅偉，孫曉飛，田景奎. 卷柏屬植物黃酮類成分研究概況[J]. 亞太傳統醫藥，2007，3（10）：63-65.

[9]畢躍鋒，鄭曉珂，史社坡，等. 卷柏屬植物化學成分與藥理活性[J]. 國外醫藥：植物藥分冊，2002，17（3）：97-100.

[10]王雅英，林小華，洪璇. 金線蓮外植體篩選及愈傷組織誘導研究[J]. 亞熱帶植物科學，2011，40（3）：41-43.

[11]王晶，李靜，賈凌云，等.朝鮮淫羊藿愈傷組織誘導研究[J]. 北方園藝，2013（12）：106-108.

[12]劉玉冰，趙昕，譚會娟. 荒漠植物紅砂愈傷組織誘導與增殖研究[J]. 中國沙漠，2008，28（2）：255-257.

[13]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等. 紅刺玫愈傷組織誘導再生體系的建立[J]. 江蘇農業學報，2012，28（4）：914-916.荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質資源遺傳多樣性SRAP標記分析[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：41-43.

2.4不同繼代時間對愈傷組織褐化的影響

試驗結果表明，不同繼代時間對愈傷組織生長情況有明顯影響，繼代時間過多或過長均不利于愈傷組織的生長（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長較慢且72.2%出現褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長較快，由淺黃色變為淺黃綠色，表面呈現油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長的繼代時間會使酚類物質的氧化產物擴散到培養基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時間對于愈傷組織褐化的影響

繼代時間

（d）1愈傷組織生長情況1褐化率

（%）151生長較慢172.2b251生長快131.1c351幾乎不生長1100.0a

3討論

本試驗分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導愈傷組織，發現外植體類型對能否誘導出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養效果最好，誘導率最高，這與王晶等[8]的研究結果一致。以幼葉為外植體沒有誘導出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現的創傷面會引起酚類等次生代謝物質的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結果相吻合[11-12]。

光照對植物胚性愈傷組織誘導的影響因物種而異。本研究發現，在暗培養條件下，中華卷柏愈傷組織誘導階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調節控制下進行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗表明，誘導率因培養基中激素的配比不同而表現出不同，并且6-BA對愈傷組織的形成起著關鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導率。在試驗范圍內，以中華卷柏莖尖為外植體誘導培養基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

參考文獻：

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[11]王晶，李靜，賈凌云，等.朝鮮淫羊藿愈傷組織誘導研究[J]. 北方園藝，2013（12）：106-108.

[12]劉玉冰，趙昕，譚會娟. 荒漠植物紅砂愈傷組織誘導與增殖研究[J]. 中國沙漠，2008，28（2）：255-257.

[13]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等. 紅刺玫愈傷組織誘導再生體系的建立[J]. 江蘇農業學報，2012，28（4）：914-916.荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質資源遺傳多樣性SRAP標記分析[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：41-43.

2.4不同繼代時間對愈傷組織褐化的影響

試驗結果表明，不同繼代時間對愈傷組織生長情況有明顯影響，繼代時間過多或過長均不利于愈傷組織的生長（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長較慢且72.2%出現褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長較快，由淺黃色變為淺黃綠色，表面呈現油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長的繼代時間會使酚類物質的氧化產物擴散到培養基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時間對于愈傷組織褐化的影響

繼代時間

（d）1愈傷組織生長情況1褐化率

（%）151生長較慢172.2b251生長快131.1c351幾乎不生長1100.0a

3討論

本試驗分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導愈傷組織，發現外植體類型對能否誘導出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養效果最好，誘導率最高，這與王晶等[8]的研究結果一致。以幼葉為外植體沒有誘導出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現的創傷面會引起酚類等次生代謝物質的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結果相吻合[11-12]。

光照對植物胚性愈傷組織誘導的影響因物種而異。本研究發現，在暗培養條件下，中華卷柏愈傷組織誘導階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調節控制下進行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗表明，誘導率因培養基中激素的配比不同而表現出不同，并且6-BA對愈傷組織的形成起著關鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導率。在試驗范圍內，以中華卷柏莖尖為外植體誘導培養基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

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[8]張紅偉，孫曉飛，田景奎. 卷柏屬植物黃酮類成分研究概況[J]. 亞太傳統醫藥，2007，3（10）：63-65.

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[11]王晶，李靜，賈凌云，等.朝鮮淫羊藿愈傷組織誘導研究[J]. 北方園藝，2013（12）：106-108.

[12]劉玉冰，趙昕，譚會娟. 荒漠植物紅砂愈傷組織誘導與增殖研究[J]. 中國沙漠，2008，28（2）：255-257.

[13]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等. 紅刺玫愈傷組織誘導再生體系的建立[J]. 江蘇農業學報，2012，28（4）：914-916.荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質資源遺傳多樣性SRAP標記分析[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：41-43.