不同因素對(duì)中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

付偉　葉嘉　張浩　紀(jì)光思

摘要：以中華卷柏為試驗(yàn)材料，比較不同外植體、不同光照條件、不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明：（1）莖尖是誘導(dǎo)中華卷柏愈傷組織的最佳外植體；（2）黑暗培養(yǎng)能夠明顯促進(jìn)愈傷組織的發(fā)生；（3）莖尖在 1/2MS+6-BA 0. 5 mg/L+2，4-D 2 mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，達(dá)55.6%。同時(shí)研究了不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織褐化的影響，結(jié)果表明：25 d繼代1次可使褐化率降至33.3%。

關(guān)鍵詞：中華卷柏；愈傷組織；誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0039-02

收稿日期：2013-08-12

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：06220111D-1）；邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：1223109092-10）。

作者簡(jiǎn)介：付偉（1978—），女，碩士，講師，主要研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。E-mail：fwximei@126.com。

通信作者：葉嘉，碩士，教授，從事資源植物開發(fā)和利用。E-mail：yejia630819@126.com。中華卷柏[Selaginella sinensis （Desv.） Spring]為卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬多年生草本植物，別稱地柏枝，主要分布于我國(guó)東北、華北等溫帶地區(qū)，是我國(guó)特有的藥用植物。中華卷柏含有穗花杉雙黃酮、羅伯斯特杉雙黃酮、銀杏雙黃酮等多種雙黃酮類化合物[1-2]。其全草為民間常用草藥，有清熱利尿、解毒散寒、消炎止血的功效，用于肝炎、膽囊炎、慢性氣管炎、慢性腎炎、濕疹、燒傷燙傷等的治療[3]。目前對(duì)中華卷柏的研究多集中在孢子形態(tài)學(xué)[4-5]、化學(xué)成分研究[5-6]、藥用價(jià)值[7-9]等方面。迄今在國(guó)內(nèi)未見有關(guān)中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道。愈傷組織誘導(dǎo)是植物生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié)[10]。通過中華卷柏愈傷組織的誘導(dǎo)，可以為利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)中華卷柏黃酮類化合物開辟有效途徑。本試驗(yàn)以中華卷柏不同外植體為試驗(yàn)材料，探討外植體種類、光照、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織的影響，以期為中華卷柏懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)、誘變、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料的滅菌及外植體的制備

供試材料采自河北省武安國(guó)家森林公園，栽植于邯鄲學(xué)院生物科學(xué)系溫室內(nèi)。選取中華卷柏的莖尖、帶葉莖段、幼葉片作為外植體材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響接種前先用洗潔精將外植體表面清洗干凈，自來水流動(dòng)沖洗30 min。然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗4次，然后用0.1%的HgCl2消毒5 min，用無菌水洗滌6次，每次3 min，用無菌吸水紙吸干水分。將莖尖和帶葉莖段切成0.5～1 cm，剪下單葉，備用。將消毒好的外植體接種在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%脂瓊+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L 的培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種24個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%。

1.2.2光照條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將消毒好的莖尖接種在上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件分別為A：光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d，溫度為 （25±1） ℃；B：暗培養(yǎng)，溫度為 （25±1） ℃。每個(gè)處理接種60個(gè)外植體，20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.3植物激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將消毒好的莖尖接種在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂并附加不同濃度的2，4-D和6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)于 （25±1） ℃ 的條件下。每個(gè)處理接種24個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況。

1.2.4繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織褐化的影響將培養(yǎng)不同時(shí)間的愈傷組織切下接種到1/2MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2 mg/L 的培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種30個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次，75 d后觀察愈傷組織生長(zhǎng)及褐化情況。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和DPS 軟件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在相同培養(yǎng)條件下，中華卷柏不同部位作為外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率不同，且差異顯著（表1）。莖尖比較容易形成愈傷組織，出愈時(shí)間較早，培養(yǎng)15 d即產(chǎn)生愈傷組織，形成的愈傷組織呈淺黃色、光滑、半透明，莖尖出愈率最高達(dá)23.6%。帶葉莖段愈傷組織誘導(dǎo)效果相對(duì)較差，出愈時(shí)間較晚，比莖尖出愈時(shí)間延長(zhǎng)1/3，出愈率也較低，為97%。幼葉的誘導(dǎo)效果最差，在培養(yǎng)30 d后全部枯萎死亡，未發(fā)現(xiàn)愈傷組織萌動(dòng)。因此莖尖是中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的外植體。

2.2光照對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

光照條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大（表2）。暗培養(yǎng)更

表1不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體類型1出愈時(shí)間（d）1誘導(dǎo)率（%）莖尖115123.6a帶葉莖段12019.7b幼葉1—10c注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

有利于卷柏愈傷組織的形成，相對(duì)于光培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率提高了13.3百分點(diǎn)。愈傷組織形成的時(shí)間也有所提前，在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)6 d后，莖尖開始增厚膨大，11 d 后在莖尖處產(chǎn)生淺黃色愈傷組織（圖1-A）。

2.3不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高達(dá)55.6%；當(dāng)6-BA為0.1 mg/L，沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。可見6-BA的濃度是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵。在一定范圍內(nèi)（0.1～0.5 mg/L），隨著6-BA濃度的增高，中華卷柏愈傷組織的誘導(dǎo)率也相應(yīng)提高；但超過其臨界濃度后，誘導(dǎo)率隨之下降。在6-BA使用濃度相同時(shí)，2.0 mg/L的 2，4-D 比1.5 mg/L的2，4-D更有利于愈傷組織誘導(dǎo)率的提高。不同濃度配比的6-BA和2，4-D對(duì)中華卷柏愈傷組織形成時(shí)間影響不大，基本出現(xiàn)在11～13 d，形成的愈傷組織顏色以淡黃色為主（圖1-A）。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，該條件下愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)55.6%。

2.4不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織褐化的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)情況有明顯影響，繼代時(shí)間過多或過長(zhǎng)均不利于愈傷組織的生長(zhǎng)（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較慢且72.2%出現(xiàn)褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較快，由淺黃色變?yōu)闇\黃綠色，表面呈現(xiàn)油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長(zhǎng)的繼代時(shí)間會(huì)使酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時(shí)間對(duì)于愈傷組織褐化的影響

繼代時(shí)間

（d）1愈傷組織生長(zhǎng)情況1褐化率

（%）151生長(zhǎng)較慢172.2b251生長(zhǎng)快131.1c351幾乎不生長(zhǎng)1100.0a

3討論

本試驗(yàn)分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)外植體類型對(duì)能否誘導(dǎo)出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養(yǎng)效果最好，誘導(dǎo)率最高，這與王晶等[8]的研究結(jié)果一致。以幼葉為外植體沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現(xiàn)的創(chuàng)傷面會(huì)引起酚類等次生代謝物質(zhì)的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結(jié)果相吻合[11-12]。

光照對(duì)植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響因物種而異。本研究發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)條件下，中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對(duì)愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進(jìn)一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調(diào)節(jié)控制下進(jìn)行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)率因培養(yǎng)基中激素的配比不同而表現(xiàn)出不同，并且6-BA對(duì)愈傷組織的形成起著關(guān)鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，以中華卷柏莖尖為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

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[12]劉玉冰，趙昕，譚會(huì)娟. 荒漠植物紅砂愈傷組織誘導(dǎo)與增殖研究[J]. 中國(guó)沙漠，2008，28（2）：255-257.

[13]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等. 紅刺玫愈傷組織誘導(dǎo)再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：914-916.荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP標(biāo)記分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：41-43.

2.4不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織褐化的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)情況有明顯影響，繼代時(shí)間過多或過長(zhǎng)均不利于愈傷組織的生長(zhǎng)（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較慢且72.2%出現(xiàn)褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較快，由淺黃色變?yōu)闇\黃綠色，表面呈現(xiàn)油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長(zhǎng)的繼代時(shí)間會(huì)使酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時(shí)間對(duì)于愈傷組織褐化的影響

繼代時(shí)間

（d）1愈傷組織生長(zhǎng)情況1褐化率

（%）151生長(zhǎng)較慢172.2b251生長(zhǎng)快131.1c351幾乎不生長(zhǎng)1100.0a

3討論

本試驗(yàn)分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)外植體類型對(duì)能否誘導(dǎo)出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養(yǎng)效果最好，誘導(dǎo)率最高，這與王晶等[8]的研究結(jié)果一致。以幼葉為外植體沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現(xiàn)的創(chuàng)傷面會(huì)引起酚類等次生代謝物質(zhì)的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結(jié)果相吻合[11-12]。

光照對(duì)植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響因物種而異。本研究發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)條件下，中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對(duì)愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進(jìn)一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調(diào)節(jié)控制下進(jìn)行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)率因培養(yǎng)基中激素的配比不同而表現(xiàn)出不同，并且6-BA對(duì)愈傷組織的形成起著關(guān)鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，以中華卷柏莖尖為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

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[13]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等. 紅刺玫愈傷組織誘導(dǎo)再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：914-916.荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP標(biāo)記分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：41-43.

2.4不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織褐化的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)情況有明顯影響，繼代時(shí)間過多或過長(zhǎng)均不利于愈傷組織的生長(zhǎng)（表4）。15 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較慢且72.2%出現(xiàn)褐化；25 d繼代1次，愈傷組織生長(zhǎng)較快，由淺黃色變?yōu)闇\黃綠色，表面呈現(xiàn)油光狀（圖1-B），褐化率僅為31.1%；35 d繼代1次，愈傷組織全部褐化死亡，這可能是由于較長(zhǎng)的繼代時(shí)間會(huì)使酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害愈傷組織。

表4繼代時(shí)間對(duì)于愈傷組織褐化的影響

繼代時(shí)間

（d）1愈傷組織生長(zhǎng)情況1褐化率

（%）151生長(zhǎng)較慢172.2b251生長(zhǎng)快131.1c351幾乎不生長(zhǎng)1100.0a

3討論

本試驗(yàn)分別以中華卷柏的莖尖、莖段、幼葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)外植體類型對(duì)能否誘導(dǎo)出愈傷組織影響較大。采用莖尖培養(yǎng)效果最好，誘導(dǎo)率最高，這與王晶等[8]的研究結(jié)果一致。以幼葉為外植體沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，可能是由于葉片切碎后出現(xiàn)的創(chuàng)傷面會(huì)引起酚類等次生代謝物質(zhì)的積累，從而在一定程度上抑制愈傷組織的形成，這與前人在其他植物中的研究結(jié)果相吻合[11-12]。

光照對(duì)植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響因物種而異。本研究發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)條件下，中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)階段的出愈率明顯高于光照條件下。可見光照對(duì)愈傷組織的形成有一定的抑制作用，抑制原因還有待于進(jìn)一步研究。

植物愈傷組織的形成是在植物激素的調(diào)節(jié)控制下進(jìn)行的[3]。以中華卷柏莖尖為外植體的組培試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)率因培養(yǎng)基中激素的配比不同而表現(xiàn)出不同，并且6-BA對(duì)愈傷組織的形成起著關(guān)鍵作用，此外選擇適宜的激素配方可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，以中華卷柏莖尖為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳激素配比為6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

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