高濕環境致大鼠腎功能損害與水通道蛋白-2的表達

楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富強，周龍甫，呼永河

高濕環境致大鼠腎功能損害與水通道蛋白-2的表達

楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富強，周龍甫，呼永河

目的 觀察高濕環境對SD大鼠腎功能的影響，探討水通道蛋白-2(AQP2)和加壓素受體-2(V2R)在高濕環境大鼠腎臟中的表達及其意義。方法 20只SD大鼠隨機分為對照組和高濕組，每組10只。高濕組大鼠每日放入人工氣候箱10 h[溫度25 ℃，相對濕度(RH)為(90±2)%]，對照組置常溫常濕環境[溫度(25±2)℃，RH(55±5)%]。處理20 d后，熒光定量PCR檢測腎髓質AQP2和V2R mRNA表達水平，Western blot法檢測腎髓質AQP2、磷酸化AQP2(p-AQP2)以及V2R的蛋白表達水平。結果 與對照組相比，高濕組大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)顯著升高(P<0.05)；腎髓質AQP2和V2R mRNA表達較對照組顯著降低(P<0.01)，AQP2、V2R的蛋白表達水平和AQP2的磷酸化水平較對照組顯著降低(P<0.05)。結論 高濕環境可對大鼠腎功能造成一定損害,且使V2R和AQP2的表達水平降低，AQP2磷酸化水平也降低，提示V2R和AQP2可能參與了高濕環境引起的腎功能損害的發生發展。

高濕環境；腎功能；水通道蛋白-2；加壓素受體-2；磷酸化

環境因素如溫度、濕度等對機體有重要影響[1]，高濕環境與高寒、高熱環境一樣，可對機體造成損傷，是誘使疾病發作的重要因素之一。研究表明，腎功能受損可能與腎髓質AQP2的表達相關[2]。水通道蛋白-2(AQP2)是加壓素(vasopresin，VP)依賴性水通道蛋白，在腎調節機體水平衡時發揮重要作用。加壓素受體-2(V2R)分布于腎臟集合管主細胞的基底側膜，通過激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)使AQP2磷酸化并重新分布，從而調節集合管對水的通透性。本研究通過觀察高濕環境對大鼠腎功能、腎髓質AQP2和VP通路受體V2R表達的影響，探討高濕環境致腎功能損害的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備 Western blot一抗兔抗大屬多克隆AQP2抗體購自ImmunoWay(YT0290)公司，p-AQP2與V2R兔抗大鼠多克隆抗體購自北京博奧森抗體公司(bs-12507R/bs-1705R)，GAPDH抗體購于上海康成生物公司(KC-5G5)，二抗羊抗兔(A0208)購自碧云天生物技術研究所；TRIzol(R0016)購自碧云天生物技術研究所； 一步法實時熒光定量RT-PCR試劑盒(RR086A)購自TAKARA公司， CFX96 PCR儀(BIO-RAD)；人工氣候箱(RXZ-1000A，寧波江南儀器廠)。

1.2 動物模型 20只SPF級雄性SD大鼠，健康狀況良好，平均體重200～220 g，由四川省醫學科學院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(川)2004]，按隨機數字表法分為正常組10只，環境實驗條件：溫度(25±2) ℃，相對濕度RH為(50±5)%；高濕組10只：采用人工氣候箱模擬高濕環境，設置條件：溫度25 ℃，RH為(90±2)%，10 h/d，共20 d。

1.3 腎功能檢測及腎臟取材 用加入EDTA的抗凝管采集每只活體大鼠的腹主動脈血液，離心收集血清后，BECKMAN COULTER AU5800全自動生化儀檢測腎功能指標(BUN、SCr)；分別取兩組大鼠的腎臟，輕輕剝離腎表面膜，分離左腎髓質，于液氮中速凍后存于-80 ℃冰箱，以備后續做AQP2及V2R分子檢測。

1.4 AQP2和V2R的mRNA表達水平檢測 按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，取40 ng RNA做實時熒光定量PCR擴增檢測，步驟及轉錄條件嚴格按試劑盒說明書進行，肌動蛋白β-actin為內參。引物序列如下:AQP2上游引物：TTGCAGGAACCAGACACTTG，下游引物:GCGGAGACGAGCACTTTTAC；V2R上游引物:TGTGGCTCTGTTTCAAGTGC，下游引物:GCCAGGATCATGTAGGAGGA；β-actin 上游引物:ACGGTCAGGTCATCACTATCG，下游引物:GGCATAGAGGTCTTTACGGATG。

1.5 AQP2、p-AQP2和V2R的蛋白表達測定 常規提取左腎髓質總蛋白，BCA法定量，以每孔50 μg上樣量為標準，進行SDS-PAGE蛋白電泳，甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH為內參。其后轉移至PVDF膜，用5%的BSA封閉膜，進行免疫結合，之后采用ECL發光法在暗室內膠片曝光成像。使用Image plus 5.0檢測條帶灰度值，并分別與相應GAPDH灰度值相比，灰度值之比作為檢測樣本的蛋白相對含量。

2 結果

2.1 高濕環境對大鼠腎功能的影響 高濕環境下，大鼠腎功能兩項指標BUN、SCr相比正常組明顯升高(P<0.05，表1)。

表1 兩組BUN、SCr及AQP2和V2R的mRNA水平的比較(n=10)

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.2 高濕環境對腎髓質AQP2和V2R的mRNA水平的表達影響 與對照組相比，高濕組AQP2和V2R的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.01，表1)。

2.3 高濕環境對AQP2、p-AQP2和V2R蛋白表達水平的影響 高濕組AQP2和V2R較對照組的蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01，圖1)，且p-AQP2較對照組表達降低尤為顯著。分析結果顯示，高濕組AQP2蛋白表達較對照組降低39.02%，而p-AQP2較對照組表達降低68.75%(表2)。

圖1 大鼠腎髓質AQP2、p-AQP2和V2R的半定量分析AQP2分子量26 kDa，p-AQP2 分子量29 kDa，V2R 分子量40 kDa，GAPDH 分子量36 kDa

表2 兩組AQP2、P-AQP2、V2R的光密度倍比值比較

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

高濕環境下動物的腎臟、肺和皮膚等都會出現不同程度損傷[3]，但其機制尚未明了。本研究通過對高濕環境下大鼠腎功能的檢測，發現BUN、SCr兩項指標顯著升高，提示高濕環境大鼠的腎功能受到損害。

已有研究發現，AQP2的表達變化與腎功能明顯相關[4]，而其表達的調節依賴于適度的VP分泌水平，VP通過與V2R的結合，一方面促進AQP2插入到頂部質膜區域，另一方面通過增強AQP2的磷酸化作用，促使腎集合管對水的通透性增強[5-7]。腎集合管內皮細胞在接收VP刺激信號前，AQP2一直處于細胞表面稱作“入胞-抵抗”的膜區域的動態平衡中，VP分泌的改變使AQP2在“入胞-抵抗”的平衡區域發生運動，同時其磷酸化的水平也相應變化[8]。李紅芬等[9]認為，p-AQP2表達與髓質纖維化、炎細胞浸潤程度呈負相關，提示大鼠腎臟p-AQP2的表達降低可能誘導髓質纖維化，炎細胞浸潤程度升高，致使腎功能受損。Di等[10]發現，AQP2與腎臟集合管水平衡控制、細胞遷移分化等進程緊密相關，AQP2表達降低可誘使腎髓質細胞遷移分化進程異常，導致腎功能程度性受損。高濕環境下，腎功能兩項指標出現增高，AQP2和V2R在mRNA和蛋白水平都相應降低，且AQP2的磷酸化水平相比總蛋白降低更為顯著，提示高濕環境腎功能受損。從AQP2和V2R的表達降低，可推斷整個機體通過腎臟呈現出對水轉運的抑制狀態；磷酸化AQP2的水平降低，說明分布于腎集合管頂部質膜的活性AQP2分子十分有限。以上結果都提示，高濕環境下腎臟對水的重吸收功能出現障礙，這種障礙的產生與AQP2的表達和磷酸化水平有著重要聯系。有研究報道，AQP2的表達改變先于SCr和BUN的變化，可作為腎功能損害的早期觀測指標[11-12]。據此推測，高濕環境對腎功能損害發生在V2R和AQP2改變之后，AQP2可以作為高濕環境對腎損傷的重要檢測指標。

總之，通過對高濕環境下大鼠腎功能、AQP2和V2R三者的監測，加深了對高濕環境腎功能損傷的認識，推測其影響機制是通過V2R-AQP2這一通路來實現的。本實驗結果支持這樣的推論，在高濕環境下，大鼠腎功能一定程度受損，V2R和AQP2的表達水平降低，AQP2的磷酸化水平也降低。但是，高濕環境是如何影響機體激素的變化，機體VP的水平到底隨高濕如何改變，是否存在其他通路導致損傷的發生，目前這些都不太清楚，需進一步研究。

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Influence of high humidity environment on rats' renal function lesion and the expression of aquaporin protein-2

Yang Yun1,Li Kun1,Li Wei1,Guo Xin1,Wang Chao2,Song Fuqiang1,Zhou Longfu3,Hu Yonghe1

1.Central Laboratory;2.Department of Laboratory;3.Department of Medical Engineering,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To observe the influence of high humid environment on SD rats' renal function,and to discuss the expression and significance of aquaporin protein-2(AQP2)and vasopressin receptor-2(V2R)in rats' kidneys in high humidity environment.Methods Twenty SD rats were randomly divided into control and high humidity groups with 10 ones in each group.The rats in the high humidity group were carried daily into artificial climatic cabinet for 10 hours[the temperature was 25 ℃,and the relative humidity was(90±2)%].The rats in the control group were put in the environment with common temperature[the temperature was(25±2)℃,and the RH was (55±5)%].After 20 d,fluorescent quantitation PCR was used to detect the mRNA expression levels of renal medull AQP2 and V2,and Western blotting method was used to detect the protein expression levels of AQP2,phosphorylated AQP2(phosphorylation of aquaporin protein-2,p-AQP2),and V2R.Results Compared with control group,the blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)in the high humidity group significantly increased compared with those indexes in the control group(P<0.05).The mRNA expression levels of renal medulla AQP2 and V2R and the protein expression levels of AQP2,p-AQP2,and V2R in the high humidity group all significantly decreased compared with those levels in the control group [(P<0.01)and(P<0.05)].Conclusion High humidity environment can cause damage of the renal function of the rats and decrease the expression levels of V2R and AQP2 and the phosphorylation level of AQP2,which indicates that V2R and AQP2 may be involved in the development of renal function lesion caused by the humid environment.

high humidity environment;renal function;aquaporin protein-2;vasopressin receptor-2;phosphorylation

全軍醫學科技“十二五”重點項目(BWS11J067)

610083 成都,成都軍區總醫院中心實驗室(楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，宋富強)，檢驗科(王 超)，醫學工程科(周龍甫)；成都軍區總醫院(呼永河)

呼永河,E-mail:huyonghe@mvip.126.com

R 692

A

1004-0188(2014)02-0123-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.003

2013-12-25)