小鼠腹腔巨噬細胞趨化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

李 軍，白樹榮，林 露，安 虹，孫陽陽，易曉波，劉英海，王軍平，粟永萍

小鼠腹腔巨噬細胞趨化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

李 軍，白樹榮，林 露，安 虹，孫陽陽，易曉波，劉英海，王軍平，粟永萍

目的 探討類固醇受體輔活化子(SRC)-3蛋白在脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞趨化和吞噬功能中的作用。方法 健康SPF級雌性野生型(SRC-3+/+)小鼠、SRC-3基因敲除(SRC-3-/-)小鼠各5只，分別分離和原代培養腹腔巨噬細胞，并相應分為SRC-3+/+組和SRC-3-/-組。收集并調整細胞濃度為1×106/ml，接種于6孔板，1 ml/孔，給予10 μg/ml LPS刺激，分別在刺激前(0 h)、刺激后4 h和12 h收集腹腔巨噬細胞。通過Western blot測定腹腔巨噬細胞Toll樣受體4(TLR4)的表達，并通過transwell趨化實驗和中性紅吞噬實驗，分別測定腹腔巨噬細胞的趨化指數(CI)和吞噬功能。結果 LPS誘導前兩組腹腔巨噬細胞TLR4的蛋白表達和CI差別無統計學意義，但SRC-3-/-組的吞噬功能顯著低于SRC-3+/+組(P<0.01)；無論是SRC-3+/+組，還是SRC-3-/-組，LPS誘導4 h和12 h后，兩組腹腔巨噬細胞TLR4的表達和CI均顯著增高(P<0.01)，但在相應時間點，SRC-3-/-組與SRC-3+/+組相比差別無統計學意義。LPS刺激4 h后，兩組吞噬功能均顯著增加(P<0.01)，但SRC-3-/-組增加的程度顯著低于SRC-3+/+組(P<0.01)；相反，LPS刺激12 h后，兩組吞噬功能均受到不同程度的抑制(P<0.05或P<0.01)，且SRC-3-/-組較SRC-3+/+組抑制的程度更低(P<0.01)。結論 SRC-3調節腹腔巨噬細胞的先天性免疫功能可能與吞噬功能有關，而與其趨化功能無關。

腹腔巨噬細胞；類固醇受體輔活化子-3；Toll樣受體4；趨化；吞噬

巨噬細胞在天然免疫反應中起重要作用，受到脂多糖(LPS)、病原體等刺激可以迅速被激活，一方面產生大量細胞因子，引起全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的發生發展，另一方面可通過趨化功能遷移到感染或受損部位，吞噬異物、清除自身衰老和凋亡細胞，從而發揮重要的細胞免疫作用。類固醇受體輔活化子(steroid receptor coactivator，SRC)家族是核受體和一些轉錄因子的輔活化子。前期通過細菌負荷實驗，我們證實SRC-3在維持機體正常的天然免疫方面具有重要作用，其蛋白缺失可降低機體清除和降解細菌及產物的能力[1]，并抑制LPS誘導的炎性細胞因子的分泌和釋放，精細地調節腹腔巨噬細胞的炎癥反應功能[2-3]。為了進一步闡明SRC-3在巨噬細胞免疫反應中的作用，本研究利用SRC-3基因敲除(SRC-3-/-)小鼠，探討SRC-3蛋白缺失對腹腔巨噬細胞趨化和吞噬功能的影響。

1 資料與方法

1.1 主要儀器 細胞培養超凈工作臺；CO2細胞培養箱；Heraeus臺式低溫高速離心機；Transwell 24孔培養板；Olympus倒置顯微鏡；Beckman DU640分光光度儀；Biorad半干轉印電泳儀；Biorad Gel Doc2000凝膠成像分析系統。

1.2 試劑 LPS(Sigma)；RPMI 1640培養基(Gibco)、胎牛血清、Hank液(Hyclone)、M-PerTMMammalian Protein Extraction Reagent(Pierce)；兔抗Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、濃縮型DAB試劑盒(中杉)；鼠源單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)(peprotech)。

1.3 方法

1.3.1 腹腔巨噬細胞分離培養 健康清潔SRC-3+/+小鼠、SRC-3-/-雌性小鼠(提取尾尖DNA，通過PCR方法鑒定[4])各5只(從美國休斯頓貝勒醫學院引進)，3月齡，參照文獻[2]方法分離腹腔巨噬細胞并接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中原代培養24 h待用。

1.3.2 腹腔巨噬細胞分組及處理 將原代培養腹腔巨噬細胞分為SRC-3+/+組和SRC-3-/-組，每只分別收集并計數，調整細胞濃度為1×106/ml，接種于6孔板，1 ml/孔，無血清培養2 h后，每孔加入10 μg/ml LPS刺激。分別在LPS刺激前(0 h)、LPS刺激后4 h、12 h收集腹腔巨噬細胞。

1.3.3 Western blot檢測腹腔巨噬細胞TLR4表達水平 取收集的腹腔巨噬細胞，按M-PerTMMammalian Protein Extraction Reagent操作說明提取總蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白行SDS-PAGE，并半干轉印至PVDF膜。PVDF膜在封閉液(0.5% BSA、0.01 mol/L PBS)內4 ℃過夜。分別加入TLR4多克隆抗體(1∶300)、GAPDH多克隆抗體(1∶800)，37 ℃孵育2 h，PBST洗膜5 min×3，再相應加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶400)，37 ℃孵育1 h，PBST洗膜5 min×3，最后DAB試劑盒顯色。通過凝膠成像分析系統分析各條帶OD值×面積(Int×mm2)，以TLR4與GAPDH的比值表示TLR4的相對表達量。

1.3.4 腹腔巨噬細胞趨化功能檢測 參照改良Boyden chamber法[5]，向transwell趨化小室上室每孔加人100 μl細胞密度為1×106/ml的腹腔巨噬細胞懸液，下室加入RPMI 1640培養基580 μl和20 μl MCP-1，置5% CO2、37 ℃培養2 h，取出小室，吸棄上室內細胞懸液，并擦凈上室膜上未遷移細胞，37 ℃預熱PBS清洗小室3次。顯微鏡下計數小室下表面的巨噬細胞數，每個小室隨機取5個視野，趨化結果以高倍視野下(×400)的趨化指數(chemotactic index，CI)表示，代表下室面每個高倍視野的平均細胞數[6]。

1.3.5 腹腔巨噬細胞吞噬功能測定 參照文獻[7]，用培養液調整LPS刺激前后的腹腔巨噬細胞至3×106/ml，0.1 ml/孔，孵育2 h，棄上清，每孔加0.72 g/L中性紅溶液100 μl，繼續孵育30 min，棄中性紅，0.01 M PBS洗4次，加入細胞裂解液200 μl，37 ℃過夜，檢測A540值，通過A540值大小來反映腹腔巨噬細胞吞噬能力的強弱。

2 結果

2.1 LPS誘導腹腔巨噬細胞TLR4的表達 正常情況下，兩組腹腔巨噬細胞TLR4的蛋白表達差別無統計學意義(P>0.05)；無論是SRC-3+/+組還是SRC-3-/-組，LPS誘導4 h和12 h后，兩組腹腔巨噬細胞TLR4的表達均顯著增高(P<0.01)，但在相應時間點，SRC-3-/-組和SRC-3+/+組相比差別無統計學意義(圖1)。

圖1 腹腔巨噬細胞TLR4 Western blot檢測結果

1～3：分別表示SRC-3+/+組12 h、4 h、0 h；4～6：分別表示SRC-3-/-組0 h、4 h、12 h

2.2 腹腔巨噬細胞的趨化功能變化 正常情況下，SRC-3+/+組和SRC-3-/-組腹腔巨噬細胞的趨化指數的差別沒有統計學意義；LPS誘導4 h后，兩組腹腔巨噬細胞的趨化指數均顯著升高(P<0.01)，12 h后均有所下降，但仍顯著高于LPS誘導前(P<0.01)；在相應時間點，SRC-3-/-組和SRC-3+/+組相比差別無統計學意義。見圖2。

圖2 腹腔巨噬細胞的趨化指數

2.3 腹腔巨噬細胞的吞噬功能變化 LPS誘導前，SRC-3-/-組腹腔巨噬細胞的吞噬功能顯著低于SRC-3+/+組(P<0.01)；LPS刺激早期(4 h)，兩組腹腔巨噬細胞吞噬功能均顯著增加(P<0.01)，但SRC-3-/-組增加的程度顯著低于SRC-3+/+組(P<0.01)；LPS刺激12 h后，無論是SRC-3+/+組還是SRC-3-/-組，腹腔巨噬細胞的吞噬功能均受到不同程度的抑制(P<0.05或P<0.01)，且SRC-3-/-組較SRC-3+/+組抑制的程度更低(P<0.01)。見表1。

表1 LPS誘導不同時間后腹腔巨噬細胞吞噬功能的變化(A540值，n=5)

注：與本組0 h相比，①P<0.05，②P<0.01；與同時間SRC-3+/+組相比，③P<0.01

3 討論

巨噬細胞是機體免疫系統的重要細胞，既有吞噬異物的非特異性免疫功能，也可通過處理和遞呈抗原參與特異性免疫反應，在天然免疫和獲得性免疫反應的始動中具有關鍵性作用。探討SRC-3蛋白在腹腔巨噬細胞趨化和吞噬功能中的作用，闡明巨噬細胞活化及隨后免疫抑制的機理，對于嚴重創傷或感染的救治具有重要的臨床意義。

體內腹腔巨噬細胞一般都處于靜止狀態，受到刺激后可以迅速被激活，產生大量的細胞因子，從而導致SIRS的發生發展。LPS是腹腔巨噬細胞激活的重要誘導劑， TLR4是介導LPS信號跨膜轉導的主要受體，LPS/TLR4/NF-κB信號通路是重要炎癥通路之一[8]。本研究發現，LPS誘導4 h和12 h后，SRC-3+/+和SRC-3-/-腹腔巨噬細胞TLR4的蛋白表達均顯著增高，但正常情況和LPS刺激下表達無顯著差別，表明SRC-3可能并不參與TLR4的蛋白表達，其與腹腔巨噬細胞的活化無關。前期研究發現，SRC-3缺失可減輕LPS誘導的炎癥反應[3]，提示SRC-3調控LPS/TLR4/NF-κB信號通路，可能不在TLR4環節，而可能在NF-κB水平[9]。

巨噬細胞遷移到感染或受損部位是細胞介導免疫反應的一個重要部分，巨噬細胞的趨化功能反映了其遷移能力，是影響巨噬細胞在生理和病理情況下發揮功能的重要因素，對于細胞趨化功能的檢測，其中最常用的方法是改良Boyden chamber法[10]。本研究發現，SRC-3+/+和SRC-3-/-腹腔巨噬細胞的趨化功能在正常情況下沒有差別，LPS刺激4 h后顯著升高，12 h后逐漸恢復，SRC-3-/-和SRC-3+/+腹腔巨噬細胞相比無顯著差別，表明SRC-3蛋白與腹腔巨噬細胞的趨化功能無關，其蛋白缺失并不影響腹腔巨噬細胞的趨化能力。

吞噬殺菌活性是腹腔巨噬細胞最基木的功能，通過吞噬異物、清除自身衰老和凋亡細胞發揮重要的細胞免疫作用，對機體自身穩態的平衡有著重要意義。采用中性紅吞噬實驗檢測腹腔巨噬細胞的吞噬功能，結果發現正常情況下SRC-3-/-腹腔巨噬細胞的吞噬功能顯著低于SRC-3+/+細胞；LPS刺激早期(4 h)，兩種腹腔巨噬細胞吞噬功能均顯著增加，但SRC-3-/-細胞增加的程度顯著低于SRC-3+/+細胞；LPS刺激12 h后，腹腔巨噬細胞的吞噬功能受到顯著抑制，但SRC-3-/-細胞較SRC-3+/+細胞抑制的程度更低，表明SRC-3蛋白與腹腔巨噬細胞的吞噬功能有關，這可能正是其蛋白缺失降低機體清除細菌能力的緣故[1，11]。SRC-3蛋白參與腹腔巨噬細胞的吞噬功能，是否還參與細菌及產物的處理與降解，目前還不清楚，這需要進一步的實驗以證實。

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Study on the role of steroid receptor coactivator-3 in chemotactic and phagocytic function of mouse peritoneal macrophages

Li Jun1,Bai Shurong1,Lin Lu1,An Hong1,Sun Yangyang1,Yi Xiaobo1,Liu Yinghai1,Wang Junping2,Su Yongping2

1.Department of Anesthesiology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Combined Injury Institute of PLA/National Key Laboratory of Trauma,Burn,and Combined Injury,the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China

Objective To investigate the effects of steroid receptor coactivator(SRC)-3 on the chemotactic and phagocytic function of lipopolysaccharide(LPS)induced mouse peritoneal macrophages(PMФ).Methods Healthy SPF-grade wild female type(SRC-3+/+)mice and SRC-3 gene knock-out(SRC-3-/-)mice were used in this study.Their PMФ were isolated and primary cultured,respectively.After the collection,the concentration of PMФ was adjusted to 1×106/ml.PMФ were cultured in 6 orifice plates with 1 ml/orifice and stimulated by 10 μg/ml LPS.Peritoneal macrophages were collected before the stimulation,4 h,and 12 h after the stimulation.The expressions of Toll-like receptor 4(TLR4)were determined by Western blot assay.The chemotactic index(CI)and phagocytic function of PMФ were examined through the Transwell chemotaxis assay and the phagocytosis of neutral red assay.Results Before LPS induction,there was no significant difference in the protein expression of TLR4 and CI between the two groups,but the phagocytic function in SRC-3-/-group was significantly poorer than that in SRC-3+/+group(P<0.01).The TLR4 expression level and the CI of PMФ in both groups significantly increased 4 and 12 h after the LPS induction(P<0.01),but there was no significant difference between the two groups at the corresponding time points.The phagocytic function of PMФ in both groups increased 4 h after the induction,but the increasing degree in the SRC-3-/-group was significantly lower than that in SRC-3+/+group(P<0.01).On the contrary,the phagocytic function in two groups were both inhibited at different degrees(P<0.05 orP<0.01)12 h after the LPS induction,but the inhibition degree in SRC-3-/-group was lower than that in SRC-3+/+group(P<0.01).Conclusion The innate immunity function of SRC-3 which regulates the peritoneal macrophages may be correlated with the phagocytic function but has no correlation with its chemotactic function.

peritoneal macrophages;steroid receptor coactivator-3;Toll-like receptor 4;chemotaxis;phagocytosis

成都軍區總醫院院管課題(2011YG-B09)；研究型人才基金和創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室開放基金(SKLKF200910)

610083 成都，成都軍區總醫院麻醉科(李 軍，白樹榮，林 露，安 虹，孫陽陽，易曉波，劉英海)；第三軍醫大學解放軍復合傷研究所，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室(王軍平，粟永萍)

粟永萍，E-mail：yongpingsutmmu@yahoo.cn

R 446.63

A

1004-0188(2014)02-0125-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.004

2013-10-31)