不同花生品種對卡那霉素的敏感性研究

張甲佳等

摘 要：

以花生胚小葉為外植體，觀察花生胚小葉在添加不同濃度卡那霉素的分化培養基上的生長狀況，研究不同花生品種對卡那霉素的敏感性，以確定各品種的卡那霉素臨界濃度。結果表明，在供試品種中，D16對卡那霉素最敏感，其臨界濃度為100 mg/L；花育22對卡那霉素的耐受性最高，其臨界濃度為200 mg/L；J11及魯花11的卡那霉素臨界濃度均為150 mg/L。

關鍵詞：花生；胚小葉；卡那霉素；敏感性；臨界值

中圖分類號：S565.203.53 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0036-03

生 （Arachis hypogaea L.）是世界四大油料作物之一，在我國經濟發展中占有重要地位，是我國重要的經濟和油料作物[1]。近幾年隨著花生離體培養的快速發展，花生遺傳轉化也飛速發展著，農桿菌介導是花生遺傳轉化最常用的方法[2～4]。在轉基因植株的初步檢測中，抗生素篩選是最為常用的方法[5～10]，其中卡那霉素最為常用[4，6～16]。卡那霉素（Kanamycin，簡稱Km）能強烈抑制細胞生長，能夠使多種植物綠色器官黃化；低濃度卡那霉素能夠抑制植物細胞分化，高濃度卡那霉素則能夠導致植物死亡[1，5，6，12，13]。在轉基因植物篩選中，常用抗性基因作為標記基因[7，11，17]，NPTⅡ、HPT、CAT、SPT、Gent等是使用最多的抗生素抗性酶基因[18]。NPTⅡ（新霉素磷酸轉移酶）基因是目前植物遺傳轉化中常用的標記基因，含有該基因的植物能夠對卡那霉素產生抗性，從而存活下來[11，17，21]。

不同花生品種對卡那霉素的敏感程度不同，單世華等[1]對泉花10號和金花1012的帶胚單子葉進行研究，得到的卡那霉素臨界濃度為200 mg/L；莊振宏等[19]研究得到泉花10號花生小葉的臨界卡那霉素濃度為150 mg/L；胡曉君等[20]的試驗結果則表明，花生離體葉片的卡那霉素篩選濃度為400 mg/L，不同苗齡葉片對卡那霉素的敏感性不同。本試驗研究了4個不同花生品種胚小葉對卡那霉素的敏感性，以期得到各品種的卡那霉素臨界濃度，為其遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

花生品種J11、花育22號、D16、魯花11號，均由山東省花生研究所提供。

1.2 試劑

卡那霉素，購于上海生工；MS基本培養基（添加適量NAA、6-BA）、分化培養基、75%乙醇、0.1%升汞，所用藥品或試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器設備

高溫高壓蒸汽滅菌鍋，江南儀器廠；人工氣候箱，寧波江南儀器廠；微量移液器，Enpendorf，德國；AA-680型原子吸收分光光度計，日本島津；J-20XP高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司；PB303-N電子精密天平，梅特勒-托利多公司；79HW-1恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器廠；PHS-3 pH計，上海精密儀器有限公司；超純水系統，Millipore，美國。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子消毒 選取成熟飽滿、活力高的花生種子，用自來水沖洗2～3次；在超凈工作臺上用75%乙醇消毒3次，1 min/次；然后用0.1%升汞浸泡10 min；再用無菌水漂洗3～4次，1 min/次，然后于無菌水中浸泡2～4 h。

1.4.2 外植體獲得 在超凈工作臺上剝去消毒處理后的種子種皮，接種于MS基本培養基上，培養4～6 d后，切取花生胚小葉作為外植體。

1.4.3 敏感性試驗 設卡那霉素濃度梯度：0、50、100、150、200 mg/L，在培養基高溫高壓滅菌并冷至65℃左右時加入。切取生長狀況良好的胚小葉，接種于添加不同濃度卡那霉素的分化培養基上，培養3周后統計各品種外植體的白化率和出愈率。

白化率（%）=白化外植體數/接種總外植體數×100

出愈率（%）=產生愈傷組織外植體數/接種總外植體數×100

2 結果與分析

2.1 卡那霉素對不同品種花生出愈率的影響

由圖1可以看出，Km濃度越高，出愈率越低；0、50 mg/L時，4個品種均能夠產生愈傷組織；100 mg/L時，D16的出愈率為零，說明與其他3個品種相比，D16對Km最為敏感；當Km濃度達到150 mg/L時，只有花育22號還有愈傷組織產生，出愈率為10%，說明4個品種中，花育22號對Km最不敏感；但當Km濃度達到200 mg/L時，4個品種均不產生愈傷組織。

圖1 各品種在不同Km濃度下的出愈率

2.2 卡那霉素對不同品種花生白化率的影響

由圖2可以看出，在未添加Km的培養基上，各品種均無白化植株出現；Km濃度為50 mg/L時，花育22號仍無明顯的白化株出現，而其他3個品種的白化率均超過了10%，D16的白化率最高，為33.33%；當Km濃度超過100 mg/L后，4個品種均有不同程度的白化。Km濃度越高，白化率越高，4個品種的白化率由高到低依次為D16>J11>魯花11號>花育22號。

圖2 各品種在Km不同濃度下的白化率

2.3 D16與花育22號在Km不同濃度下的生長狀況比較

上述分析顯示，4個品種中D16對Km最敏感，而花育22號對Km的耐受性最高。由兩者培養3周后的生長狀況（圖3、圖4）可以看出，兩品種間差異明顯，在添加50 mg/L Km的培養基上，花育22號產生愈傷組織的外植體數明顯多于D16，而D16的白化率也明顯高于花育22號。

圖3 D16在Km不同濃度下的生長狀況

圖4 花育22號在Km不同濃度下的生長狀況

3 討論與結論endprint

王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內源抗性有差異[7]。本試驗結果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養基上出現明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養基上即出現明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

參 考 文 獻：

[1]

單世華，李春娟，劉思衡，等. 以農桿菌為介導花生遺傳轉化研究[J]. 中國油料作物學報，2003，25（1）：9-13.

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[4] 梁麗琨，由翠榮，林榮雙，等. 花生基因工程[J]. 生物學通報，2005，40（10）：3-5.

[5] 王萍，張淑珍，李文濱，等. 大豆不同品種基因型胚尖不定芽的誘導及對抗生素的敏感性[J]. 作物雜志，2010（2）：50-53.

[6] 劉方，張寶紅，姚長兵，等. 卡那霉素對棉花胚性愈傷組織生長發育的影響[J]. 棉花學報，1999，11（2）：70-72.

[7] 張靜妮，馬暉玲，曹志忠. 紫花苜蓿不同品種對卡那霉素敏感性分析[J]. 草原與草坪，2005（5）：30-33.

[8] 盧龍斗，李愛花，彭仁海，等. 茶菊再生體系及其卡那霉素篩選體系的建立[J]. 安徽農業科學，2009，37（21）：9872-9875.

[9] 徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對花粉管通道法轉基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學，2006（3）：275-278.

[10]彭金庫，徐青青，周莉凡，等. 卡那霉素和潮霉素對蘆竹不定芽誘導與生長的影響[J]. 安徽農業科學，2011，39（15）：8858-8860.

[11]李玲. 楊樹對卡那霉素（Kanamycin）敏感性的測定[J]. 林業科學，1992，28（1）：95-96.

[12]劉玉匯，張俊蓮，王蒂，等. 不同煙草品種對卡那霉素抗性及耐鹽性的差異[J].中國農學通報，2008，24（3）：180-185.

[13]尹智慧，宋麗莉，司亮，等. 大巖桐葉片再生體系的建立及卡那霉素敏感性研究[J]. 北方園藝，2013（10）：100-102.

[14]張寅玲，劉艷軍，張偉玉，等. 番茄基因轉化中抗生素篩選壓力的確定辦法[J]. 西南園藝，2005，33（5）：4-6.

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[18]侯愛菊，朱延明，張晶，等. 轉基因植物中篩選標記基因的利用及消除[J]. 遺傳，2003，25（4）：466-470.

[19]莊振宏，朱錦懋，陳由強，等. 花生再生和轉化體系的初步研究[J]. 福建師范大學學報（自然科學版），2001，17（4）：88-113.

[20]胡曉君，劉風珍，萬勇善，等. 花生組織培養及苗期nptⅡ標記基因篩選劑適宜濃度的研究[J]. 山東農業大學學報（自然科學版），2007，38（1）：28-34.

[21]Nap J P，Bijvoet J，Stiekema W J. 轉基因植物中的卡那霉素抗性[J]. 司家鋼譯. 生物技術通報，1998（1）：29-31.

[22]任艷，王輝，石延茂，等. 抗生素在花生組織培養中的抑菌效應研究[J]. 山東農業科學，2011（10）：74-75.endprint

王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內源抗性有差異[7]。本試驗結果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養基上出現明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養基上即出現明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

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王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內源抗性有差異[7]。本試驗結果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養基上出現明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養基上即出現明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

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