溶磷真菌PFK—1的解磷能力及其對油菜的促生作用

徐文鳳　邢芳芳　宋濤　胡兆平　李新柱

摘要：利用固體、液體培養法測定溶磷真菌PFK-1的解磷能力；通過盆栽試驗，研究其對油菜的促生作用及對土壤磷素變化的影響。試驗結果表明，以Ca3（PO4）2為唯一磷源的液體培養基，接種參試菌株PFK-1，在28℃、120 r/min條件下培養144 h溶磷量高達768.1 mg/L；液體培養基中pH值隨溶磷量的增加而下降，在144 h時液體培養基pH值降至1.87，以后仍繼續保持在低pH值水平；盆栽試驗表明，與單施硝基肥的處理相比，1%、2%微生物與硝基肥復配的處理，油菜鮮重和干重增長率分別為7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分別增加了30.27%、52.36%。

關鍵詞：真菌PFK-1；溶磷能力；促生作用

中圖分類號：S154.38文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0085-05

磷是植物生長發育所必需營養元素之一，是植物體內核酸及多種酶、輔酶、ATP等的重要組成成分，在植物生長發育中的作用僅次于氮[1，2]。土壤中95%以上的磷是植物不易吸收利用的難溶性磷，我國土壤中的磷素含量較低，約74%的耕地土壤缺磷[3]，約66.7%嚴重缺磷[4]。因此，必須向土壤中施入大量可溶性磷肥，以提高作物產量，但當季磷肥利用率較低，約為5%～10%[5]，大部分磷與Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+結合形成難溶性磷酸鹽，作物難以利用，使得磷元素在土壤中大量積累，降低磷利用率并帶來嚴重的環境污染。

近年來，利用植物根際與磷循環相關的生物學系統來調節植物根際磷的有效性，特別是利用解磷微生物來活化土壤難溶性磷，已成為提高土壤磷有效性的研究熱點[6]。土壤中具有解磷作用的微生物包括細菌、真菌和放線菌等，其中解磷真菌的溶磷能力較強，而且遺傳性狀相對穩定。具有解磷能力的微生物能夠將難溶性無機磷轉化為可溶性磷，它們以自身的代謝產物或者與其他微生物協同作用溶解土壤中難溶性無機磷，以提高土壤中磷的利用率、有機質含量、作物產量，改善土壤結構，并減少化肥的施用量，降低農業成本，是增加土壤中可溶性磷的重要途徑之一[7]。

本研究對溶磷真菌PFK-1進行了一系列試驗，觀察其在固體無機磷培養基上溶磷圈大小，測定其對無機磷液體培養基的溶磷能力；在盆栽試驗中，研究其對油菜的促生作用以及對土壤中有效磷變化的影響，為利用溶磷菌提高土壤中磷利用率提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株溶磷真菌PFK-1，由山東金正大生態工程股份有限公司研發中心微生物實驗室分離保存。

1.1.2培養基馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。用于溶磷真菌的培養。

無機磷固體培養基[8]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4 ·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·H2O 0.03 g，Ca3（PO4 ）2 5.0 g，瓊脂 20 g，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。

無機磷液體培養基[8]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g， KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4 ·H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，定容至 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

查氏酵母膏瓊脂培養基（CYA）：K2HPO4 1.0 g，查氏濃縮液 10.0 mL，酵母抽提粉5.0 g，蔗糖30.0 g，瓊脂 15.0 g，無菌水 1 000 mL。

查氏濃縮液配方： NaNO3 30.0 g， KCl 5.0 g， MgSO4·7H2O 5.0 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.05 g，無菌水100 mL。

1.1.3儀器設備主要有Biolog 微生物自動分析系統 （Gen III Microstation 自動微生物鑒定系統）、立式電熱蒸汽壓力滅菌鍋、紫外可見分光光度計、烘箱、空氣浴培養搖床、超凈工作臺、生化培養箱、電子天平。

1.2試驗方法

1.2.1固體培養條件下溶磷能力測定將純化后的溶磷菌株接種于無機磷固體平板上，重復3次。28℃恒溫倒置培養7 d測定菌落直徑（d）及溶磷圈直徑（D），根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）大小初步確定該菌株溶磷能力的強弱，以無溶磷能力的對照菌株為參照。

1.2.2液體培養條件下溶磷能力測定 將供試溶磷菌株接種到PDA平板上，待菌落長滿平板后，用直徑0.6 cm打孔器取一菌塊接種到裝有200 mL無機磷液體培養基的500 mL三角瓶中，28℃、120 r/min 振蕩培養。分別在24、48、72、96、120、144 h時取出過濾去除菌絲，用鉬藍比色法測定濾液OD700的吸光值及pH值，通過有效磷含量標準曲線計算溶液中有效磷含量，以確定菌株對Ca3（PO4 ）2 的溶磷能力。

磷標準溶液：準確稱取0.2195 g經105℃烘干的KH2PO4（分析純），溶解在400 mL水中，加濃硫酸5 mL，轉入1 L容量瓶中，加水定容。此溶液為50 μg/mL 磷標準溶液。吸取該磷標準溶液25 mL，稀釋至250 mL，即為5 μg/mL 磷標準溶液。標準曲線繪制參考文獻[9]。

1.2.3溶磷真菌形態鑒定及Biolog鑒定將溶磷真菌接種于CYA平板上，25℃倒置培養7 d后，觀察菌落外部形態及產孢梗、孢子等性狀，參照文獻[10，11]進行菌株初步鑒定。endprint

初步確定微生物類型后，在麥芽汁瓊脂培養基中進行擴大培養，然后接種到Biolog專用接種液IF-FF中制備成均一的菌懸液，轉接到鑒定板上進行培養，培養24、48、72、96、168 h后在讀數儀上讀取數據，并在 Biolog 數據庫中進行相似性比對，查找最接近的結果。

1.2.4溶磷真菌PFK-1對盆栽油菜生長的影響試驗將制備好的溶磷真菌孢子粉，按不同配比包裹在（N-P-K）15-6-20硝基肥復混肥顆粒表面，制成微生物包裹型肥料。試驗設2個處理，3個對照，重復3次。

處理：T1施用1%微生物包裹型硝基肥1.2 g；T2施用2%微生物包裹型硝基肥1.2 g。

對照：CK0不施肥；CK1施用溶磷真菌孢子粉0.024 g；CK2施用硝基肥1.2 g。

將采自山東省臨沭縣的農田土（土壤類型為棕壤、質地為砂壤、pH值5.42、有機碳 0.89%、全氮 654.05 mg/kg、有效磷 39.46 mg/kg、速效鉀 59.88 mg/kg）在室內風干，粉碎后裝入直徑18 cm、高18.5 cm的塑料盆中，每盆2 kg。將處理好的肥料與土壤摻混均勻，播種油菜（Brassica napus） 蘇州青種子6～8粒，澆水。盆栽從2013年5月14日開始至7月1日收獲，共48天，油菜長出2片真葉后間苗定植，每盆2株，于收獲時測定鮮重及葉片數，烘干后稱干重。

土壤有效磷采用NaHCO3浸提、鉬藍比色法測定 [12]。

試驗數據采用Excel 進行處理，SPSS 17.0軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1難溶無機磷固體培養條件下溶磷能力

溶磷圈的大小，是表征溶磷菌相對溶磷能力的一個指標，大致可以說明此溶磷菌分解無機磷能力的強弱，從而可以初步判斷溶磷菌溶磷能力。將溶磷真菌接種至無機磷固體培養基平板上，倒置培養7 d后，形成肉眼可見的透明溶磷圈（圖1），溶磷真菌菌落直徑d=4.5 cm，溶磷圈直徑D=8.1 cm，D/d=1.8。表明該溶磷真菌在難溶性無機磷固體培養基上生長良好，其溶磷能力較好。

2.2難溶無機磷液體培養條件下溶磷能力及pH值變化

2.2.1溶磷能力根據1.2.3的方法繪制磷含量與吸光度之間的標準曲線。標準曲線方程為y=1.9095x-0.0014 （R2=1.0000），相關性達極顯著水平。根據該標準曲線方程及溶磷真菌培養液的OD值，可以計算出培養液中的磷含量。

無機磷液體定量測磷方法能夠更精確地確定溶磷真菌的解磷能力。由表1可以看出，與對照（CK）相比，隨著培養時間的變化，培養液中有效磷含量顯著增多，培養144 h時溶磷量達到768.1 mg/L，溶磷率達76.8%；總體上，培養時間為24～144 h，液體培養基中有效磷含量隨時間增加而增大。

2.2.2不同培養時間液體培養基pH值變化溶磷真菌PFK-1在液體培養基中培養144 h，液體培養基pH值變化過程見圖2。從圖中可以看出：液體培養基對照初始pH值為7，接種溶磷真菌后，隨著培養時間的增加，液體培養基的pH值明顯下降，培養144 h時，pH值下降至1.87。

2.3溶磷真菌形態鑒定及Biolog鑒定

2.3.1培養特征觀察在CYA培養基上培養7 d后，菌落直徑7.4 cm，初期產生白色菌絲，后期形成大量黑色孢子；菌落呈暗黑褐色，菌落絲絨狀，中心凸起，有放射狀溝紋。菌落背面黃色至黃褐色（圖3-A）。

2.3.2顯微形態觀察挑取適量菌體，制作顯微形態觀察玻片，在光學顯微鏡下觀察，分生孢子頭球形，分生孢子梗無隔膜，頂端膨大形成球形頂囊，直徑50～80 μm，在頂囊上生出2層小梗，下面一層是梗基，每個梗基上著生幾個小梗，每個小梗頂端生出一串分生孢子。分生孢子球形，直徑3.0～4.5 μm，壁粗糙（圖3-B）。初步確定供試溶磷真菌PFK-1為曲霉屬真菌（Aspergillus spp.）

2.3.3Biolog鑒定結果根據菌株的培養類型，將菌株接種到麥芽汁瓊脂培養基上，3 d后用棉簽沾起孢子，分散到IF-FF專用接種液中，制備成均一的菌懸液，調整濁度到（75±2）%，接種到FF鑒定板上，接種量 100 μL，26℃培養，在培養24、48、72、96、168 h讀取數據一次；培養72 h后，鑒定結果為巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis），PROB為99.8%，SIM為0.76，DIST為4.00。

2.4溶磷真菌PFK-1對油菜的促生長作用及土壤有效磷變化

由表2可以看出，施用溶磷真菌處理能夠提高油菜的鮮重與干重，增加土壤有效磷含量，對油菜的生長發育有一定的促生作用。單獨施用溶磷真菌的CK1與不施用任何肥料的CK0相比，鮮重與干重均有顯著提高，分別增長11.21%和14.09%。而施用硝基肥與溶磷真菌的T1、T2處理與單施硝基肥的CK2比較，鮮重分別增加7.19%與22.15%，干

3結論與討論

目前已報道的具有溶磷能力的微生物包括細菌、真菌和放線菌等。溶磷真菌種類數量比溶磷細菌少得多，但溶磷真菌溶磷活性均高于細菌[13]。溶磷真菌類主要有青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Asperillus）、根霉（Rhizopus）、鐮刀菌（Fusarium）、小菌核菌（Selerotium）等[14]。研究表明，在為數眾多的溶磷微生物中，曲霉的溶磷活性最高[15]，溶磷能力在300～400 mg/L之間。本研究中，結合形態鑒定和Biolog自動微生物鑒定系統鑒定，得出溶磷真菌PFK-1是巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）；其具有較強的溶磷能力，在無機磷液體培養基培養條件下，隨著培養時間的增加，溶磷量增大；培養144 h時溶磷量為768.1 mg/L，溶磷率達76.8%，這與Cerezine等[16]報道的曲霉在液體培養過程中隨著菌絲體的生長，對難溶性磷酸鹽的溶解能力逐漸增加相符合。Agnihotd[17]報道一株曲霉在30℃條件下培養20 d，磷礦粉中87.7%的磷可被釋放出來。陳明會等[18]從滇池流域富磷區篩選獲得的 48 株溶磷真菌對Ca3（PO4）2 有較好的溶磷效果，釋放的有效磷含量在14.45～64.87 mg/L 之間，其中黑曲霉 （Aspergillus niger）PSF 47的溶磷能力最好，釋放的有效磷含量達64.87 mg/L。endprint

范丙全等[19]在測定溶磷草酸霉菌溶磷圈大小時得出，培養第7 d時D/d值在1.07 ～1.26之間；林啟美等[20]測得培養7 d時芽孢桿菌屬溶解無機磷的D/d 值范圍為 1.14 ～1.43。本研究中，在固體培養條件下，D/d為1.8，表明該株溶磷真菌PFK-1具有較強的溶磷能力。

溶磷真菌在液體中培養時，能夠產生草酸、檸檬酸等多種有機酸[21]，從而使pH值降低。趙小蓉等[22]發現溶磷量與培養液中的pH值存在一定的相關性，但培養介質pH值的下降，并不是微生物溶磷的必要條件。本研究中，隨著pH值的下降，溶磷量增加，培養144 h時溶液pH值下降至1.87，溶液中有效磷含量最大為768 mg/L，具有一定的相關性。溶磷菌培養液中 pH值下降的原因，可能是因為溶磷菌溶解釋放出的游離磷改變了培養液的酸堿度，也可能是溶磷菌本身向周圍環境分泌酸性物質或者兩者兼而有之[23]。

溶磷真菌能夠溶解土壤中的難溶性磷，促進植物對磷素的吸收，從而促進植物的生長和發育。在植物根系接種溶磷真菌不僅可以提高植物吸收磷素，轉化難溶性磷為有效磷[24]；也能夠促進植物對水分的吸收和利用，提高植物的抗旱能力[25]；還能夠增強葉片的光合作用，提高植物的碳素營養， 促進植物生長，增加植物的生物量或干重[26]。本試驗中，溶磷真菌PFK-1對油菜有明顯的促生作用，能不同程度地提高鮮重和干重，與單施硝基肥的對照相比，處理T1、T2油菜的鮮重和干重分別增加了7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分別增加了30.27%、52.36%。

溶磷微生物在土壤中存活及溶磷特性受到土壤環境和作物生長等諸多因素影響。本試驗中，溶磷菌對油菜生長影響只進行了盆栽試驗，雖表現良好，但實驗室條件與大田土壤環境條件差異很大，對菌株促生效應發揮有較大影響。所以，驗證菌株在大田土壤中的定殖、生長和生存能力應作為后續研究工作的重點。

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范丙全等[19]在測定溶磷草酸霉菌溶磷圈大小時得出，培養第7 d時D/d值在1.07 ～1.26之間；林啟美等[20]測得培養7 d時芽孢桿菌屬溶解無機磷的D/d 值范圍為 1.14 ～1.43。本研究中，在固體培養條件下，D/d為1.8，表明該株溶磷真菌PFK-1具有較強的溶磷能力。

溶磷真菌在液體中培養時，能夠產生草酸、檸檬酸等多種有機酸[21]，從而使pH值降低。趙小蓉等[22]發現溶磷量與培養液中的pH值存在一定的相關性，但培養介質pH值的下降，并不是微生物溶磷的必要條件。本研究中，隨著pH值的下降，溶磷量增加，培養144 h時溶液pH值下降至1.87，溶液中有效磷含量最大為768 mg/L，具有一定的相關性。溶磷菌培養液中 pH值下降的原因，可能是因為溶磷菌溶解釋放出的游離磷改變了培養液的酸堿度，也可能是溶磷菌本身向周圍環境分泌酸性物質或者兩者兼而有之[23]。

溶磷真菌能夠溶解土壤中的難溶性磷，促進植物對磷素的吸收，從而促進植物的生長和發育。在植物根系接種溶磷真菌不僅可以提高植物吸收磷素，轉化難溶性磷為有效磷[24]；也能夠促進植物對水分的吸收和利用，提高植物的抗旱能力[25]；還能夠增強葉片的光合作用，提高植物的碳素營養， 促進植物生長，增加植物的生物量或干重[26]。本試驗中，溶磷真菌PFK-1對油菜有明顯的促生作用，能不同程度地提高鮮重和干重，與單施硝基肥的對照相比，處理T1、T2油菜的鮮重和干重分別增加了7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分別增加了30.27%、52.36%。

溶磷微生物在土壤中存活及溶磷特性受到土壤環境和作物生長等諸多因素影響。本試驗中，溶磷菌對油菜生長影響只進行了盆栽試驗，雖表現良好，但實驗室條件與大田土壤環境條件差異很大，對菌株促生效應發揮有較大影響。所以，驗證菌株在大田土壤中的定殖、生長和生存能力應作為后續研究工作的重點。

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范丙全等[19]在測定溶磷草酸霉菌溶磷圈大小時得出，培養第7 d時D/d值在1.07 ～1.26之間；林啟美等[20]測得培養7 d時芽孢桿菌屬溶解無機磷的D/d 值范圍為 1.14 ～1.43。本研究中，在固體培養條件下，D/d為1.8，表明該株溶磷真菌PFK-1具有較強的溶磷能力。

溶磷真菌在液體中培養時，能夠產生草酸、檸檬酸等多種有機酸[21]，從而使pH值降低。趙小蓉等[22]發現溶磷量與培養液中的pH值存在一定的相關性，但培養介質pH值的下降，并不是微生物溶磷的必要條件。本研究中，隨著pH值的下降，溶磷量增加，培養144 h時溶液pH值下降至1.87，溶液中有效磷含量最大為768 mg/L，具有一定的相關性。溶磷菌培養液中 pH值下降的原因，可能是因為溶磷菌溶解釋放出的游離磷改變了培養液的酸堿度，也可能是溶磷菌本身向周圍環境分泌酸性物質或者兩者兼而有之[23]。

溶磷真菌能夠溶解土壤中的難溶性磷，促進植物對磷素的吸收，從而促進植物的生長和發育。在植物根系接種溶磷真菌不僅可以提高植物吸收磷素，轉化難溶性磷為有效磷[24]；也能夠促進植物對水分的吸收和利用，提高植物的抗旱能力[25]；還能夠增強葉片的光合作用，提高植物的碳素營養， 促進植物生長，增加植物的生物量或干重[26]。本試驗中，溶磷真菌PFK-1對油菜有明顯的促生作用，能不同程度地提高鮮重和干重，與單施硝基肥的對照相比，處理T1、T2油菜的鮮重和干重分別增加了7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分別增加了30.27%、52.36%。

溶磷微生物在土壤中存活及溶磷特性受到土壤環境和作物生長等諸多因素影響。本試驗中，溶磷菌對油菜生長影響只進行了盆栽試驗，雖表現良好，但實驗室條件與大田土壤環境條件差異很大，對菌株促生效應發揮有較大影響。所以，驗證菌株在大田土壤中的定殖、生長和生存能力應作為后續研究工作的重點。

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