基于量子點標記技術的雞新城疫病毒sFLISA檢測技術研究

房保海　孫濤　賈俊濤　岳志芹　姜英輝　趙玉然　梁成珠　徐彪

摘要：本研究建立了基于量子點的雞新城疫病毒（NDV） sFLISA檢測方法。該方法以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體、以生物素標記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體、以量子點標記的鏈霉親和素為熒光探針。該方法與其它有關禽類病毒（產蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒）無交叉反應，比血凝試驗靈敏，為臨床早期快速檢測NDV提供了行之有效的方法。

關鍵詞：雞新城疫病毒（NDV）；量子點；雙抗夾心熒光免疫分析（sFLISA）

中圖分類號：S858.31文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0118-04

新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接觸性傳染病，常呈敗血癥，主要特征是呼吸困難、下痢、神經機能紊亂、黏膜和漿膜出血，嚴重危及禽類養殖業的發展，現流行于世界各國[1～3]。新城疫被國際獸疫局（OIE）定為A類傳染病，中國將其列為一類動物疫病[4]。

新城疫病毒的檢測主要應用免疫方法（包括免疫傳感技術、蛋白質芯片技術、膠體金免疫層析技術、免疫組化技術、免疫熒光技術等）和分子生物學技術（包括RT-PCR技術、基因芯片、液相芯片技術等）[5]。量子點（Quantum dots，QDs）是近年發展起來的一種新型熒光納米材料，與傳統有機熒光染料相比，具有熒光穩定性高、吸收光譜寬、發射光譜窄而對稱、衰減壽命長、生物相容性好等特點，已經成為病原檢測的新工具[6～9]。

本研究以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體，以生物素標記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體，以量子點標記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了NDV sFLISA檢測方法，為養殖業早期發現NDV感染提供了有力的工具。

1材料與方法

1.1試驗材料

滅活新城疫病毒（NDV，HA效價為256）和陽性尿囊液病毒由本試驗室保存。雞產蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品、抗雞新城疫病毒陽性血清和雞新城疫試驗用陰性血清購自國家獸醫微生物菌種保藏中心。

1.2主要試劑和抗體

兔抗NDV多克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV單克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子點標記的鏈霉親和素-605（QS605，武漢珈源量子點技術開發有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；洗滌液：0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS）；封閉液：1× BSA-PBS。

1.3主要儀器和器材

多功能熒光酶標儀（SpectraMax M5）；6930型冷凍離心機（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；MS3渦流旋轉振蕩儀（德國IKA公司）；黑色底透的熒光酶標板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液槍（0～200 μL、0～1000 μL，德國Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏溫度（4±1）℃，中國海爾]；恒溫培養箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。

1.4尿囊液病毒的制備

4℃反復凍融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各離心30 min，上清經100 000×g離心2 h，用少量 TEN 緩沖液將病毒沉淀懸浮，再用20%～60%的蔗糖溶液經密度梯度離心純化，經100 000×g 離心8 h，收集40%～60%梯度層內的病毒帶，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分裝，于-20℃凍存備用。

1.5 sFLISA標準操作程序

sFLISA在NUNC酶標板反應微孔中完成，具體實驗方法如圖1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗體在4 ℃包被過夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液）；洗滌液洗滌3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封閉，300 μL/孔，37℃ 封閉2 h；洗滌液洗板3次后，加入待測樣品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀釋的生物素標記NDV單克隆抗體，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子點標記的鏈霉親和素熒光探針，37℃孵育1 h，洗板后晾干。陰性對照孔加陰性血清，空白對照孔加入100 μL PBS，通過熒光分光光度計測定其相對熒光強度。

1.6sFLISA工作條件的優化

1.6.1多抗包被濃度、生物素標記單克隆抗體稀釋度的確定抗NDV多克隆抗體以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等5個稀釋濃度各100 μL豎排包被聚苯乙烯板，4℃過夜；洗滌封閉后加入標準抗原NDV，100 μL/孔，固定標準抗原NDV濃度；洗滌拍干，生物素標記抗NDV單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800共3個稀釋濃度各100 μL反應，37℃作用1 h；洗滌拍干，加入1∶100稀釋的量子點標記的鏈霉親和素，37℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標儀上用390 nm的激發波長、605 nm的發射波長讀取相對熒光強度（RFU）值。根據P/N比值，以確定包被抗體和生物素標記抗體的最佳濃度。

1.6.2量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數的優化以NDV包被酶標板，生物素標記抗體按1∶200稀釋作為檢測抗體，量子點標記的鏈霉親和素分別按照1∶50、1∶100、1∶200稀釋，100 μL/孔加入，37 ℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標儀上用390 nm的激發波長、605 nm的發射波長讀取相對熒光強度（RFU）值。根據P/N比值，以確定量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數。endprint

1.7陰陽性判定標準的確定

采用建立的sFLISA方法進行12次陰性對照檢測，計算相對熒光單位RFU的平均值（X）和標準差（SD），陽性臨界值=陰性樣品的X+3SD。檢測時，當樣品RFU>陽性臨界值，判斷為陽性。

1.8sFLISA敏感度檢測

確定單抗和多抗的最佳工作濃度，將純化的尿囊液病毒在1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280等8個稀釋度進行測定，同時進行原倍毒液試驗，設陰性和空白對照。

1.9sFLISA特異性試驗

用建立的檢測方法對NDV、雞產蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進行檢測，確定所建立檢測方法的特異性。

1.10重復性試驗

在同一個酶標板內檢測NDV、NDV國家標準品和尿囊液制備的NDV，每樣重復3次；選取3塊不同酶標板，每個板重復3孔，按1.5的步驟進行sFLISA，分別計算樣品的板內和板間變異系數（CV）。

1.11阻斷試驗

將陽性NDV用滅菌生理鹽水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋后，50 μL分別加入等量的標準陽性血清（1∶10稀釋），37℃作用1 h，10 000 r/min離心，取上清進行檢測，以NDV為陽性對照。

2結果與分析

2.1包被多克隆抗體與生物素標記抗體稀釋度的確定

包被抗體分別以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL進行包被，生物素標記抗體分別進行1∶200、1∶400、1∶800的稀釋，量子點標記的鏈霉親和素以1∶100的稀釋度進行偶聯。結果表明，包被抗體單抗為1.25 μg/mL，生物素標記的檢測抗體1∶200時，其P/N值最大，為56.028。因此，選擇1.25 μg/mL作為包被抗體的濃度，1∶200 作為生物素標記抗體的最佳稀釋度（見表1）。

2.2量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數優化

以上述優化的條件，即包被抗體濃度為1.25 μg/mL，生物素標記的檢測抗體稀釋倍數為1∶200，對量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數進行優化。結果（表2）表明，在1∶100時，P/N值為61.453，最大，故選擇此稀釋倍數為最優稀釋倍數。

2.3 sFLISA陰陽性界限的確定

在上述優化的反應參數條件下，進行12次陰性血清sFLISA試驗，得到陰性試驗平均值為0.361，標準差為0.037，X+3SD =0.472，從而確定RFU 值在0.472及以上為陽性，RFU值在0.361～0.471之間為疑似，RFU值在0.361以下為陰性（表3）。

2.4 敏感性分析

將制備好的尿囊液NDV以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280等8個稀釋度稀釋，按照優化sFLSA的條件檢測結果表明，隨著病毒含量的降低，其RFU 值呈下降趨勢，但當病毒1∶640 稀釋時，結果仍為陽性（RFU值為0.725），表明該方法靈敏度較好。

2.5 特異性試驗

在已優化的sFLISA反應條件的基礎上，對雞產蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進行了檢測，結果只有雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品為陽性，其它病毒均為陰性，表明本方法具有較好的特異性（表5）。

2.6重復性試驗

在同一酶標板內，對NDV、NDV國家標準品和尿囊液制備的病毒進行板內重復性試驗，每份樣品重復3次。重復性分析結果顯示：板內變異系數為1.5%～4.1%，板間變異系數為1.5%～3.0%（表6），變異程度很小，均小于10%，表明該方法具有較好的重復性。

2.7阻斷試驗

結果表明（表7），經稀釋的NDV作為被檢材料，標準陽性血清能特異性地阻斷NDV與包被抗體的結合，病毒1∶40稀釋后檢測結果呈陰性。

量子點作為一種新型的熒光探針，被越來越多地應用到病原生物檢測中[8]，但應用于動物病毒檢測的研究較少。本研究應用量子點標記的鏈霉親和素作為熒光探針、生物素標記單克隆抗體作為檢測抗體，通過生物素-親和素之間的特異性互作，建立了一種基于量子點熒光探針的NDV sFLISA檢測方法。通過對已知陽性樣品的比較測定，陽性樣品稀釋至640倍還能檢出；與其它有關禽類病毒無交叉反應（產蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原），說明此檢測方法對NDV特異性較強，靈敏度高。該方法的建立為NDV的監測和診斷提供了新方法，在進出口檢疫上也將發揮良好的作用。

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