可斷裂聚乙二醇和穿膜肽共修飾脂質體腫瘤靶向作用初步研究

石志蓉，肖羽君

(1. 廣東省珠海市第二人民醫院藥劑科，廣東 珠海 519070; 2. 聯邦制藥有限公司中山分公司，廣東 中山 528400)

腫瘤是目前全球致死率排名第2 的疾病，目前臨床的主要治療方法有化學治療(簡稱化療)、手術、放射治療(簡稱放療)、中藥、免疫、分子靶向等。化療是臨床應用最廣泛的治療手段，但全身不良反應較明顯，給患者造成了較大痛苦[1]。20 世紀初，部分學者對藥物靶向治療展開了研究，有望進行選擇性給藥，對于提高治療效果、降低不良反應均有重要意義。其中，脂質體以其疏水、親水雙構造特性在許多疾病的治療中受到了廣泛關注[2]。筆者探討了可斷裂藥用聚乙二醇(PEG)和穿膜肽(TAT)共修飾脂質體用于腫瘤靶向治療的效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑包括大豆卵磷脂、膽固醇、1640 培養基、TritonX-100、Sephadex-G50、胎牛血清、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、牛血清白蛋白等，均購自專業生產廠家。脂質體制備設備為ZHWY-100H型恒溫空氣搖床、RE-200B 型旋轉蒸發儀、恒溫水浴鍋、AL204-IC 型電子天平、超聲細胞粉碎機等，檢測觀察設備為RF-5301 型熒光分光光度計、Sizer Nano ZS90 型激光粒度儀、ZETA 電位分析儀、倒置熒光顯微鏡、Agilent 6410 型質譜儀、HPLC/LC/24-AD 型高效液相色譜儀、ELX800 型酶標儀等。

1.2 脂質體制備

脂質體制備采用薄膜分散-超聲法。取SPC，CHo，DSPEPEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 等，劑量參照文獻[3]。將上述藥劑置50 mL 茄型瓶中，加入氯仿進行溶解，旋轉、蒸發后置真空干燥器中，24 h 后加入pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)2.5 mL，并將所得物質置入37 ℃恒溫空氣搖床中，以180 r/min 的速率離心20 min 后，水化10 min，水浴超聲脫膜5 min，并使用超聲探頭(80W)掃描15 次，每次5 min，即得所需可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質體。

1.3 觀察項目

1.3.1 質譜鑒定

使用LA-24AD 型高效液相色譜儀進行粗分離，使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法檢測純度后，收集主峰，參照文獻[4]進行質譜鑒定。鑒定參數:曲形脫溶劑裝置(CDL)250 ℃;電壓:檢測器1.5 kV，探針4.5 kV，CDL-20 V;流速:霧化器1.5 L/min;流動相:0.2 mL/min;全掃描質量范圍:400 ～1 500 m/z。

1.3.2 體外活性

取SMMC-7721 人肝癌細胞株及LO2 人正常肝細胞株，分別納入觀察組及對照組，均將其培養至90%匯合后，使用PBS 漂洗2 次，接種于12 孔板，接種密度為5×104個/孔，每孔再加入DMEM(含共修飾脂質體100 μg /mL)，孵育3 h 后用PBS 漂洗5次，加入4%多甲醛進行細胞固定，觀察其體外活性。

1.3.3 細胞生物學活性

將SMMC-7721 人肝癌細胞株接種于12 孔板，接種密度為5 ×103個/孔，培養12 h 后，分別向各孔加入共修飾脂質體，質量濃度依次為0，20，40，80，100，120，140，160，180 μg/mL，用酶標儀觀察各質量濃度溶液490 nm 波長處的吸光度(D490)[5]。

1.4 統計學處理

數據采用SPSS 13.0 統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t 檢驗。檢驗水準設定為α=0.05，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質譜鑒定結果

經鑒定，合成的共修飾脂質體雜質較少，其相對分子質量約為3 622.4，純度約為96.1%，圖像表現為主峰峰面積較高，見圖1。

2.2 體外活性觀察結果

白色光、熒光及重疊后，觀察組均可見胞內紅色細胞大量分布，且集中于胞質內。見圖2。

圖1 共修飾脂質體高效液相色譜圖

圖2 共修飾脂質體的體外活性

2.3 細胞生物學活性觀察結果

不同質量濃度共修飾脂質體對SMMC-7721 的細胞生物學活性影響與對照組比較，無明顯差異，見表1。

表1 共修飾脂質體對SMMC-7721 細胞生物學活性的影響(± s)

表1 共修飾脂質體對SMMC-7721 細胞生物學活性的影響(± s)

組別對照組觀察組質量濃度(μg/mL)0 20 40 60 80 D490 D490 0.210 70±0.017 64 0.023 51±0.019 50 0.023 28±0.003 98 0.230 90±0.015 34 0.214 80±0.025 88組別觀察組質量濃度(μg/mL)100 120 140 160 180 0.238 10±0.039 08 0.024 09±0.001 97 0.023 50±0.016 30 0.023 59±0.011 94 0.229 80±0.013 85

3 討論

臨床腫瘤治療最常見的手段是化療，但多種化療藥物在消滅腫瘤細胞時對患者正常細胞也造成了極大損害，常引發骨髓抑制、免疫下降甚至心血管系統、消化系統毒性，使患者治療耐受性大幅下降，影響了治療依從性及治療效果[6]。因此，尋找合適的脂質體攜帶藥物到達腫瘤位置進行靶向治療一直是醫學研究的重點。

筆者參考在前人研究的基礎上制備了可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質體，其依據主要為:可斷裂PEG 能夠使脂質體的作用時間延長，且能夠幫助其越過網狀內皮吞噬環節，并增強攜帶藥物的滲透作用，具有較佳的腫瘤靶向性;TAT 又稱蛋白轉導域，具有親水、疏水兩端，能夠促進藥物的細胞內攝取;PEG 對脂質體與腫瘤細胞的作用存在影響，同時，TAT 選擇特異性較差，不利于其在腫瘤內的長期蓄積[7]。因此，將可斷裂PEG 及TAT 制備為共修飾脂質體，有望達到協同作用的目的，發揮二者的優勢。

由質譜鑒定結果可見，合成的共修飾脂質體雜質較少，其相對分子質量約為3 622.4，純度約為96.1%，提示可斷裂PEG 和TAT 合成純化效果十分明顯，與預期理論相對分子質量3 622.37無明顯差異，合成效果理想。體外活性觀察可見，白色光、熒光及重疊后觀察組均可見胞內紅色細胞大量分布，且集中于胞質內，這表明共修飾脂質體具有較佳的體外活性，即共修飾脂質體可選擇性進入腫瘤細胞，而不會進入正常細胞株，顯示了其良好的細胞靶向性[8]，且合成的共修飾脂質體進入腫瘤細胞后多集中于細胞質位置，有利于靶向藥物作用的發揮，具有良好的臨床應用前景。為進一步分析該共修飾脂質體的安全性，筆者對靶向細胞活性的變化進行了分析，并發現不同質量濃度共修飾脂質體對SMMC-7721 細胞生物學活性與對照組比較無明顯差異，提示共修飾脂質體的質量濃度不會影響細胞的活性，不會引發細胞活性改變，進而有效地防止了細胞毒性反應的發生[9]，具有良好的安全性。此外，Cole 等[10]指出，可斷裂PEG 能促進共修飾脂質體通過正常毛細血管壁，減少了攜帶藥物在其他非靶向部位的分布。這也大大降低了藥品不良反應的發生率，且在保護心肌方面作用最顯著[11-13]。

綜上所述，可斷裂PEG 和TAT 共修飾脂質體的穩定性較高，制備工藝便捷，具備良好的藥物承載性和安全性，且存在良好的細胞內外傳遞潛能，腫瘤靶向性極佳，具有良好的臨床應用前景，值得進一步研究。

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