N-三甲基殼聚糖不同季銨化程度對塞來昔布脂質體體外性質的影響

龔道凱

(湖北省潛江市中心醫院藥劑科，湖北 潛江 433100)

塞來昔布(CLX)為非甾體抗炎藥，對骨關節炎、風濕性關節炎及外周和中樞疼痛有較好的療效[1]。目前，CLX 制劑主要為口服的片劑和膠囊劑，易產生胃腸道不良反應及心血管、肝膽及腎臟危害[2-3]，因此積極研制其透皮吸收給藥系統有較大的應用前景[4]。由于CLX 的難溶性，在自然條件下穿透完整皮膚較困難，而脂質體作為透皮吸收給藥系統的載體，可很好地包封難溶性藥物，并可促進藥物穿透角質層，在皮膚中蓄積，提高局部藥物濃度，同時可減少全身吸收，降低不良反應[5-6]。已有大量研究表明，N-三甲基殼聚糖(TMC)作為一種陽離子多糖，其正電荷與體內負電荷成分作用，可打開細胞間緊密聯接，從而促進藥物的黏膜及皮膚吸收[7-8]，且促吸收作用與TMC 的季銨化程度(DQ)呈正相關。本試驗中擬將不同季銨化程度的TMC 作為透皮促進劑，用于CLX 脂質體(CLXL)中，考察TMC 對CLXL 體外性質的影響及其與季銨化程度之間的關系，為篩選出較好的TMC 類透皮吸收促進劑奠定實驗基礎。

1 儀器、試藥與動物

RE-52C 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);Zetasizer 3000 型HS 激光粒度分析儀(英國Malvern 公司);TEM-100 CXⅡ型透射電鏡(日本電子公司);1000 型Agilent 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);EmulsiFlex-C5 型高壓均質機(加拿大Avestin 公司);TP-3A 型智能藥物透皮擴散實驗儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

CLX 原料藥(江蘇澳新生物工程有限公司，批號為1208137);CLX 對照品(印度Pharma Links 制藥公司，批號為CX/1204，含量為99.77%);卵磷脂，膽固醇，維生素E(國藥股份有限公司);TritonX-100(日本株式會社);TMC20，TMC40 及TMC60(武漢大學藥學院贈予，季銨化程度分別為20.2%，40.1%，64.4%);氮酮(山西芮城興慶化工廠，批號為121010)。

昆明種健康小鼠，雄性，體重20 ～25 g，購自武漢大學動物實驗中心，許可證號為SCXK(鄂)2008-0004。

2 方法與結果

2.1 制劑制備

CLXL:根據預試驗結果，并參考文獻[6]，采用薄膜分散法制備CLXL。稱取卵磷脂140 mg，膽固醇70 mg，維生素E 4 mg，置茄形瓶中，加入適量氯仿溶解，再加入CLX 30 mg，振搖溶解后，置50 ℃水浴中旋轉減壓蒸發溶劑，直至瓶壁上形成磷脂薄膜，繼續蒸發45 min，以完全除去溶劑。取下茄形瓶，加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.5)10 mL，再旋轉水化，直至所有磷脂膜均勻混懸于PBS 中。經高壓均質機在20 kpsi(1.4 ×106 kPa)壓力下經100 nm膜擠壓乳勻10 ～15 次，即得CLXL。

TMC 與CLXL 的混合物:分別取TMC20，TMC40，TMC60(與脂材比例為1 ∶4[9]，W/ W)52.5 mg，溶于10 mL CLXL 混懸液中，攪拌均勻，即得3 種TMC 與CLXL 的物理混合物。

含氮酮的CLXL:取氮酮52.5 mg，加入10 mL CLXL 混懸液中，攪拌均勻，即得。

2.2 形態觀察

分別取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 適量，加蒸餾水適當稀釋后，取1 滴，滴至覆有支持膜的銅篩網上，用2%磷鎢酸溶液染色，自然揮干后樣品在100 kV 下以透射電子顯微鏡進行觀察。結果見圖1。可見，各種TMC 對CLXL 的形態均不產生顯著影響，外觀呈圓整球形，粒徑較均勻。

2.3 粒徑及Zeta 電位測定

分別取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 適量，用蒸餾水適當稀釋后，加入樣品池中，用激光粒度分析儀進行測定。結果見圖2 和表1。可見，TMC 與CLXL 混合后，CLXL 的平均粒徑略有增大，但無顯著性差異(P ＞0.05);而Zeta 電位由負轉正，且粒徑及Zeta 電位均隨季銨化程度的增大而逐漸增大，差異具有顯著性(P ＜0.05)。

圖1 透射電子顯微鏡照片

圖2 CLXL 及TMC60 與CLXL 混合物的粒徑及Zeta 電位測定結果

2.4 包封率測定

分別精密吸取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL0.1 mL，置25 mL 容量瓶中，加入10% TritonX-100 溶液0.5 mL，將脂質體充分溶解，用甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續濾液進樣測定[10]，得總藥物含量(Cz);另分別精密吸取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 4.0 mL，置離心管中，并放入超速離心機中，于10 ℃以下以50 000 r/min 的速率離心1 h，離心完畢后，取上清液經微孔濾膜過濾后進樣，測定游離藥物含量(Cy)。計算包封率Y(%)=(Cz- Cy)/ Cz×100%。結果見表1。可見TMC 對CLXL 的包封率無顯著性影響。

表1 各種CLXL 粒徑及Zeta 電位測定結果(n=3)

2.5 小鼠離體皮膚滲透性考察

斷頸法處死小鼠，剔除背部毛發，剝取皮膚，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈，泡于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存，24 h內使用;Franz 擴散池透皮有效面積為1.32 cm2，接受池體積為15 mL，磁力攪拌速度為200 r/min，(32 ±1)℃恒溫水浴，接受液為含30%甲醇的磷酸鹽緩沖液(pH=6.5);將小鼠離體皮膚固定在供給池與接受池之間，角質層面向供給池，接受液液面恰與皮膚下層接觸，無氣泡。供給池分別給予CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 及含氮酮的CLXL 各1.0 mL，分別于給藥后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，19.0，24.0 h 時精密吸取接受液2.0 mL，同時補充同溫、同量的新鮮接受液。取出的接收液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，續濾液適當稀釋后進樣測定藥物濃度Cn，按以下公式計算累積滲透量Q。

式中Cn 為第n 個取樣點的藥物濃度(μg/mL)，V 為取樣體積(mL)，A 為滲透面積。

以Q(μg/cm2)為縱坐標、時間t(h)為橫坐標作圖，得Q- t曲線(n=3)，見圖3(Q4 與Q5 幾乎重合)。將數據進行模型擬合，取相關系數最大者為最佳擬合方程，結果見表2。結果表明，5 種CLXL 體外透皮特征均符合Higuchi 方程，其方程斜率即為穩態透皮速率J[μg /(cm2·h)]。與CLXL 相比，各種TMC 均產生明顯的透皮吸收促進效果(P ＜0.05)，且隨著季銨化程度的增加，促進效果越明顯，其中TMC60 與氮酮相比，促進作用無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖3 體外累積透皮量Q 與時間t 的關系曲線(n=3)

3 討論

藥物既要有一定的親水性，又要有一定的親脂性，才能穿透完整的皮膚。CLX 為難溶性藥物，在自然情況下很難透皮吸收。本試驗的主要目的是利用脂質體為載體，較好地包封CLX，并利用脂質體的皮膚吸收促進作用，結合陽離子多糖TMC 為吸收促進劑，達到提高CLX 透皮吸收效果的目的。前期試驗已經證實，TMC 與CLXL 混合使用的促進效果要明顯高于TMC 包衣CLXL，故本試驗采用不同季銨化程度TMC 與CLXL 混合，并著重探討其促滲效果與季銨化程度之間的關系。由于季銨化程度在20% ～80%之間的TMC 水溶性較好，而季銨化程度高于60%時合成較困難，故本試驗選用季銨化程度的范圍為20% ～60%。

表2 體外累積透皮量Q 與時間t 的擬合方程

本試驗結果表明，TMC 與CLXL 混合后，CLXL 的粒徑有所增加，可能的原因是CLXL 帶負電，TMC 帶正電，由于靜電吸引，有部分TMC 吸附于CLXL 表面，從而使粒徑增大，且隨著季銨化程度的增加，TMC 所帶正電荷增加，吸附作用更加明顯，粒徑也相應增大;同時，也使整個體系的Zeta 電位由混合前的負電荷轉變為混合后的正電荷;但TMC 對CLXL 的形態及包封率并無顯著性影響。

體外透皮試驗結果證實，TMC 對CLXL 的透皮促進作用，且與其季銨化程度呈明顯的正相關，從而表明其作用機理與其所帶正電荷與皮膚中負電荷成分相互作用有關[8]。有關體內相關研究正在進行中。

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