硝態氮對Nannochloropsis oculata生長及合成胞內組分的影響

鞏 波，袁 軍，陳金花，李昌靈，夏小樂，楊海麟

（江南大學教育部工業微生物技術重點實驗室，江蘇無錫 214122）

微綠球藻屬（Nannochloropsis）是一種海洋單細胞微藻，屬于褐藻門真眼點藻綱，藻細胞呈球形或卵圓形，直徑2～4μm［1］。微綠球藻最突出的特點是生長快、耐受性好、富含不飽和脂肪酸特別是二十碳五烯酸（EPA），具有很高的營養價值和保健功能。此外，由于微綠球藻具有較高的光合效率，能夠吸收CO2生成油脂和高附加值EPA等優良特性，逐漸成為可持續生物質資源開發的熱點［2］。藻細胞的生長、油脂含量及脂肪酸組成與外界營養條件密切相關，并且在營養限制條件下油脂蛋白等胞內組分的合成差異顯著［3］。其中氮源是構成生物體的蛋白質、核酸及其他氮素化合物的材料，與細胞生長、胞內組分合成密切相關［4］。Illman 等［5］報道在氮限制條件下，C.emersonii、C.minutissima、C.vulgaris及C.pyrenoidosa能夠積累的最高油脂量分別達到細胞干重的63%、57%、40%和23%。梁英等認為不同的氮源和不同的氮濃度對微藻的脂肪酸組成影響顯著［6］。Recht等［7］研究結果表明H.Pluvialis油脂積累過程中碳水化合物含量逐漸升高至63%，之后開始下降，而Nannochloropsissp.在此過程中碳水化合物始終穩定在18%左右。本文以硝酸鈉為氮源，通過考察不同氮濃度下Nannochloropsis oculataC170生長、氮消耗及油脂含量變化，并在此基礎上結合透射電子顯微鏡等技術手段，分析氮限制條件下油脂、總糖、蛋白等胞內組分合成差異，以探索硝態氮對細胞生長及胞內組分合成的影響，為微綠球藻生物質資源的開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微綠球藻藻株Nannochloropsis oculataC170 購于中國海洋大學微藻種質庫（MACC）;培養基 f/2海水培養基［8］（單位 mg/L）:NaNO375，NaH2PO4·2H2O 5.65;微量元素:Na2EDTA 4.16，FeCl3·6H2O 3.15，ZnSO4·7H2O 0.022，CuSO4·5H2O 0.01，MnCl2·4H2O 0.18，Na2MoO4·2H2O 0.006，CoCl2·6H2O 0.01;維生素濃縮液:Vitamin B120.0005，Vitamin B10.1，Biotin 0.0005;Nile red Sigma－Aldrich 公司;環氧樹脂Epon812、鋨酸 美國Ted Pella公司;其余分析用藥品為分析純 上海國藥集團。

YXQ－LS－50S1型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;ZHWY200B型搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;DHP－2000型電熱恒溫培養箱 天津市華北實驗有限公司;分析天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;U3900紫外分光光度計 日立公司;F－4600熒光分光光度計 日立公司;GC－2010氣象色譜儀 日本島津;JEM－2100透射電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氮濃度實驗 取適量活化藻種接種于含有f/2培養基的100mL三角瓶中，置于恒溫光照搖床中振蕩培養，培養條件為:光照周期為16∶8（光照∶黑暗，h/h），溫度為（25 ± 1）℃，pH 為 8.0，光照強度4000lux的培養條件下培養6d。取上述處于對數生長期的微綠球藻種子液，接種于裝有400mL新鮮f/2培養基的500mL反應瓶中，以NaNO3作為氮源分別調整其氮濃度為 12.5、22.5、32.5、42.5mg/L，初始接種濃度為（0.072 ± 0.001）g/L，連續通氣（氣流量為0.1vvm，由底部通入），其余培養條件不變。

1.2.2 氮限制處理 氮濃度設置為2mg/L，初始接種濃度為（0.274 ±0.006）g/L，其余培養條件同 1.2.1。

1.2.3 生物量和生長速率測定 生物量的測定參考Li等［9］方法，用紫外－可見分光光度儀測定688nm波長處各稀釋樣品的吸光值，同時將對應樣品離心洗滌，干燥至恒重后測定藻體干重，建立回歸方程:生物量（g/L）=0.1828X－0.009（R2=0.9927）。培養液用滅菌雙蒸水進行10倍濃度梯度稀釋測定，并根據回歸方程計算生物量。生物量產率及比生長速率（μ）根據下式計算:生物量產率（mg/（L·d））=（X2－X1）/（t2－t1），μ =（1nX2－lnX1）/（t2－t1），其中:X1是第一次取樣時（t1）的生物量，X2是第二次取樣時（t2）的生物量。

1.2.4 氮含量檢測 微綠球藻培養液于10000r/min離心5min后，收集上清液用于氮含量測定，氮含量測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894－89，水質總氮的測定）。氮消耗速率和氮利用率根據下式計算:氮消耗速率（mg/（L·d））=（Co－Ct）/t，氮利用率（%）=（Co－Ct）/Co× 100，其中:Co為初始氮濃度，Ct為t時培養液中氮濃度，t為培養時間。

1.2.5 生理參數的測定 葉綠素a含量的測定采用甲醇提取法［10］。蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法［11］，蛋白質含量（mg/L）= 氮含量（mg/L）× 6.38。總糖含量的測定采用苯酚－硫酸比色法［12］。油脂含量的測定采用修改的 Nile red法［13］，油脂含量（μg/mL）=0.0713X+5.9027（r2=0.9923）。

1.2.6 油體及葉綠體透射電鏡觀察 培養液離心去上清，用 PB 緩沖液（pH7.5）洗滌兩次，2.5%（w/v）戊二醛4℃固定2d，充分漂洗后用1%（w/v）鋨酸4℃固定2h，用系列酒精、丙酮梯度脫水各30min，然后用Epon812 包埋聚合（35℃ 16h，48℃ 24h，65℃ 48h）。金剛石刀超薄切片后用200目銅網收集。經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，JEM－2100透射電子顯微鏡觀察［14－15］。

1.2.7 脂肪酸組成分析 總脂的提取按照Bligh和Dyer［16］的方法，將總脂轉移到玻璃瓶中，加入 0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2mL，充N2后密封于65℃反應1h。冷卻后加入25%三氟化硼甲醇溶液2mL，65℃酯化 20min，正己烷萃取后進樣分析。色譜柱:CP－WAX（30m × 0.32mm × 0.5um），FID 檢測器。程序升溫:100℃恒溫3min，10℃/min的升溫速率升高到180℃，之后3℃/min升高到240℃并保持9min。進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250℃。載氣N2流速為3mL/min，H2流速為47mL/min，空氣流速為400mL/min，分流比為1∶10，進樣量 1μL。

1.2.8 數據分析方法 采用origin軟件進行統計分析，每個實驗重復3次，實驗所得值為平均值加上標準偏差。

2 結果與討論

2.1 硝態氮濃度對微綠球藻生長的影響

以NaNO3為氮源，不同氮濃度下N.oculataC170生長情況如圖1和圖2所示。在42.5mg/L氮濃度培養基中藻細胞生長最佳，第5d開始生物量快速上升并明顯高于其他實驗組。培養至11d，其生物量、比生長速率及產率均最高，分別為 0.59g/L、0.275d－1和50.98mg/（L·d）。圖1 同時顯示在 0～2d 內，藻細胞生長緩慢。第2d開始進入對數生長期，藻細胞快速增殖，生物量呈現快速上升趨勢。隨著氮濃度的升高，N.oculataC170最高生物量顯著增加，高濃度硝態氮明顯有利于細胞生長。

圖1 不同氮濃度下N.oculata C170的生長曲線Fig.1 The growth curves of N.oculata C170 under different nitrogen concentrations

根據圖2可知，N.oculataC170培養11d后，其生物量產率和比生長速率隨著氮濃度的升高而增加，氮濃度為12.5mg/L時，藻細胞生長受限，其比生長速率和生物量產率最低，分別為0.244d－1和36.43mg/（L·d），顯著低于其他實驗組。此種現象主要是由于氮源不足時，光合相關色素及酶系合成受到抑制，光合作用嚴重受阻，藻細胞生長緩慢導致生物量和產率下降。氮源充足時，藻細胞可以合成大量葉綠素，PSⅡ處于高活性狀態具有較高的光合效率，細胞生長迅速其生物量和產率顯著增加［17－18］。

圖2 不同氮濃度下N.oculata C170生物量產率和比生長速率Fig.2 Productivity and specific growth rate of N.oculata C170 under different nitrogen concentrations

2.2 硝態氮消耗與利用率

N.oculataC170培養在不同氮濃度條件下，硝態氮的消耗情況和利用效果顯著不同，結果見圖3和圖4。在0～2d內，藻細胞仍處于遲緩期導致氮的利用較為緩慢，之后藻細胞進入快速增殖期，氮的利用速度逐漸加快。隨著藻細胞濃度的升高，氮含量在不斷的降低（圖3）。

不同濃度下的N.oculataC170培養至11d時對氮的利用效果如圖4所示。氮濃度為12.5mg/L時，氮源在第4d基本耗盡，至培養結束其氮利用率最好（接近100%），而氮消耗速率為各實驗組最低，僅為2.07mg/（L·d）。氮濃度高于 22.5mg/L 時，藻細胞生長繁殖迅速，氮消耗速率不斷升高，同時培養液中殘留氮濃度不斷升高，導致藻細胞對氮的利用率不斷降低。在42.5mg/L氮濃度下，其氮消耗速率最高，為2.71mg/（L·d），但此時氮含量遠遠超過了藻細胞生長所需量，氮利用率為各實驗組最低，僅為69.95%。

圖3 不同氮濃度下N.oculata C170氮消耗曲線Fig.3 Nitrogen consumption curves of N.oculata C170 under different nitrogen concentrations

圖4 不同氮濃度下N.oculata C170對氮的利用效果Fig.4 Results of consumption of nitrogen by N.oculata C170 under different nitrogen concentrations

2.3 硝態氮濃度對胞內油脂含量的影響

在不同硝態氮濃度下，N.oculataC170經培養11d后，其油脂合成差異顯著（圖5）。在12.5mg/L氮濃度時，胞內油脂含量和產率明顯最高，分別為29.17%和 11.40mg/（L·d）。隨著氮濃度的升高，油脂含量迅速下降，在32.5mg/L氮濃度時，油脂含量僅為 8.74%，其油脂產率則下降到 4.29mg/（L·d）。氮濃度進一步增大到42.5mg/L時，油脂含量及產率基本與32.5mg/L處理組一致。對比發現，12.5mg/L氮濃度下藻細胞油脂含量是42.5mg/L處理組的3.4倍，原因可能是在12.5mg/L氮濃度時，培養液中氮含量無法滿足細胞生長所需，氮源耗盡后導致藻細胞的增殖能力下降，促使細胞調整代謝流向合成含氮較少的脂類化合物作為儲藏能源物質，從而具有較高的油脂含量［19－20］。

圖5 不同氮濃度下N.oculata C170油脂含量和油脂產率Fig.5 Content and productivity of lipid of N.oculata C170 under different nitrogen concentrations

2.4 硝態氮濃度對脂肪酸組成的影響

考察了不同硝態氮濃度下N.oculataC170脂肪酸組成差異，培養11d后各實驗組脂肪酸組成如表1所示。結果表明，棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1）及 EPA（C20∶5）始終是N.oculataC170的主要脂肪酸。隨著培養基中氮濃度的增加，棕櫚油酸、油酸的比例顯著下降，分別下降了25%和74%左右。相反多不飽和脂肪酸（PUFA）的比例顯著增加，由 14.07%升高至 28.43%，其中EPA 含量由 8.06% 升高到 18.76%，為最初的 2.32倍。氮濃度為42.5mg/L時，藻細胞EPA和PUFA含量最高。這很可能是由于氮濃度的增加導致合成多不飽和脂肪酸所需的蛋白酶系濃度上升，進而提高了多不飽和脂肪酸的比例。

表1 不同氮濃度下N.oculata C170脂肪酸組成（%總脂肪酸）Table 1 The fatty acid composition of N.oculata C170 under different nitrogen concentrations（%total fatty acid）

2.5 氮限制處理與胞內組分合成

為進一步研究硝態氮對N.oculataC170胞內組分合成的影響，以2mg/L氮濃度作為氮限制處理，考察了生物量、pH、葉綠素a含量以及油脂、總糖等細胞組分的變化規律，結果如圖6和圖7。培養6d時，藻細胞生物量緩慢增加，由0.27g/L逐漸升高到0.34g/L，表明細胞分裂仍可以緩慢進行。在此過程中，pH首先呈現上升趨勢，第4d達到最高值9.59，之后略有下降。而葉綠素a含量從10.4mg/g快速升高到 21.34mg/g，隨后下降到 7.29mg/g，下降了 29% 左右，表明在培養后期胞內色素合成嚴重受阻。Li等［21］推測在低氮濃度下，氮源被藻細胞快速耗盡，結果是光源穿透性較好細胞被暴露于大量的光源下，腺苷一磷酸（AMP）脫氨酶活性增加，AMP脫氨酶將AMP大量轉化為肌苷一磷酸（IMP）和氨。細胞利用此種內源性氮源維持色素供給、細胞分裂增殖等生命活動。隨著氮的持續消耗，PSⅡ氧化端受到損失，抑制了光合作用原初反應的進行，細胞色素含量下降，分裂增殖逐漸停滯［22－23］。

圖6 N.oculata C170氮限制下生物量、pH及葉綠素a變化Fig.6 Variation of growth，pH and chl a of N.oculata C170 under nitrogen－limiting conditions

圖7 微綠球藻C170缺氮條件下的細胞組分變化Fig.7 Variation of cellular compositions of N.oculata C170 under nitrogen－limiting conditions

另一方面，氮限制條件下胞內組分隨著培養時間的延長差異顯著（圖6）。在培養6d過程中，油脂與總糖含量都呈現上升趨勢，油脂含量最高達到23.07%，為最初含量的 2.8 倍?？偺莿t從 12.45% 逐漸升高至22.01%，含量升高了76%左右。而胞內蛋白含量與油脂變化趨勢相反，在1～3d內基本穩定在41%左右，之后明顯下降，第6d時蛋白含量下降至31.31%，下降了 24% 左右。Kawata 等［24］認為微藻光合作用所固定的碳進入磷酸已糖庫后，一方面以淀粉形式儲存在葉綠體內，另一方面，還可通過糖酵解途徑生成丙酮酸作為合成脂肪酸的前體。由于氮源不足時，蛋白質和葉綠素等含氮元素較多的物質合成受到限制，導致藻細胞蛋白與氨基酸嚴重下降，而二氧化碳的同化作用仍部分進行，導致碳代謝流向碳水化合物或者脂質，積累大量糖類或油脂［25－26］。

2.6 氮限制條件下藻細胞油體與葉綠體變化

N.oculataC170在氮限制培養時，其胞內油體與葉綠體結構變化如圖8所示，接種第2d時，藻細胞仍可以利用培養液中微量氮源生長繁殖，胞內葉綠體占細胞比例較大且類囊體片層結構緊密相連（圖8A）。培養到第4d時，藻細胞開始衰敗，葉綠體明顯松散，類囊體片狀結構清晰可見，葉綠體所占比例明顯下降（圖8B），這與上述葉綠素含量降低的結果相一致。培養到第6d時，由于細胞液及液泡的變化，葉綠體被壓縮到較小區域，并且此時藻細胞內可見明顯脂肪體（圖8C）。

圖8 氮限制處理對N.oculata C170油體和葉綠體的影響（25000倍）Fig.8 TEM photos of cellular lipid body and chloroplast from N.oculata C170 under nitrogen－limiting conditions（25000×）

3 結論

N.oculataC170 在 42.5mg/L 氮濃度培養基中生長最佳，其生物量、比生長速率及產率均最高，分別為 0.59g/L、0.275d－1和 50.98mg/（L·d），此時氮消耗速率高達 2.71mg/（L·d），而氮利用率最低，僅為69.95%。氮濃度為12.5mg/L時，藻細胞內油脂含量和產率明顯最高，分別為 29.17% 和 11.40mg/（L·d）。隨著氮濃度的升高，多不飽和脂肪酸比例顯著增加，氮濃度為42.5mg/L時，藻細胞EPA和PUFA含量最高，分別為 18.76%和 28.43%，EPA 含量為最初的 2.32 倍。

在限氮處理時，藻細胞生物量緩慢增加，葉綠素a含量下降了29%左右。同時油脂含量逐漸升高至23.07%，為最初含量的2.8倍。總糖含量則逐漸升高至22.01%，提高了76%左右而蛋白含量下降了24%左右。透射電鏡下藻細胞內可見葉綠體結構松散且比例下降，并可觀察到明顯油體積累。本研究表明，高濃度硝態氮有利于N.oculataC170細胞生長及胞內EPA積累，低濃度硝態氮誘導油脂積累并與糖類合成、色素和蛋白降解相關聯。提高硝態氮濃度可用于N.oculataC170中EPA的生產，而通過氮限制或代謝工程等手段抑制糖類積累或控制蛋白微量分解則可以促進油脂積累。

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