“益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠免疫功能影響的實驗研究

易清清 譚 瑩 李 曰 杜 斌 馮 磊 邱麗穎 (江南大學藥學院，無錫214122)

現今治療腫瘤不僅注重治療效果，同時更注重機體的反應性。對腫瘤及宿主雙方面因素綜合考慮，采用扶正與祛邪相結合，以增加和調動機體自身抗癌能力，是當前惡性腫瘤治療的一種常用的方法［1］。中醫藥的抗腫瘤療效顯著，毒副作用小，對腫瘤患者免疫調節作用具有明顯的優勢［2］。中醫藥從調節免疫功能出發，配合化療可起到增效減毒作用，并改善患者低下的免疫功能。中醫治療中晚期惡性腫瘤以扶正培本為主，也是中醫治療惡性腫瘤的最大特色，而最突出的就是提高患者免疫功能，改善臨床癥狀和生存質量，提高生存率［3］。“益元抑瘤湯”是臨床的經典驗方，在無錫市中西醫結合醫院已經作為醫院制劑進行臨床治療使用，對腫瘤病人作為輔助藥物治療效果顯著。本研究觀察“益元抑瘤湯”水煎液對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響，為闡明該方的臨床應用效果提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 PRMI1640培養液(美國Gibco公司);脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(Con A)、甲基偶氮唑鹽(MTT)、IL-2試劑盒、TNF-α 試劑盒、印度墨汁(北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(Sigma公司)。

1.2 受試藥的制備 根據無錫市中西醫結合醫院制劑制備工藝，取“益元抑瘤湯”一個處方量:黃芪20 g、合歡皮15 g、靈芝10 g、茯苓20 g、女貞子10 g、浙貝母10 g。加水1 020 ml，浸泡30 min，加熱煮沸兩次，每次2 h，過濾，合并濾液。濃縮，干燥，粉碎后備用。于動物實驗前用蒸餾水溶解成所需濃度。

1.3 動物模型的建立 H22小鼠肝癌細胞株(上海醫藥工業研究院藥理學研究室)，動物腹腔內接種傳代。腹腔接種H22腹水7 d的瘤源鼠脫頸處死，無菌抽取腹水，在顯微鏡下進行細胞計數，然后用生理鹽水稀釋，調整細胞數至2×107～3×107個/ml。取0.2 ml注入雌性ICR小鼠(上海斯萊克試驗動物有限責任公司)右腋皮下［4］。將接種的小鼠隨機分為三組，每組10只:腫瘤對照組，陽性參一膠囊(生產廠家:吉林亞泰制藥股份有限公司，批號:20120502)組，“益元抑瘤湯”劑量組，另取未接種小鼠作為正常對照組。接種H22細胞后次日開始給藥，連續灌胃給藥14天，每日給藥一次。每日給藥前記錄各組動物的體重、飲食、毛發、活動、精神狀態等體征。

1.4 藥物用量 正常對照組:生理鹽水0.1 ml/10 g體重;腫瘤對照組:蒸餾水0.1 ml/10 g體重;陽性對照組:參一膠囊，按說明書由人換算成小鼠給藥濃度為80 mg/ml/10 g體重;“益元抑瘤湯”組:醫院臨床用量為每日14.1 g，換算成小鼠給藥濃度為181.8 mg/ml/10 g體重。

1.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的測定 給藥14 d后，實體瘤小鼠摘眼球取血0.5～1 ml，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取血清置于 -20℃保存，IL-2、TNF-α試劑盒測定。

1.6 小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖的測定 給藥14 d后，脫頸處死動物，75%酒精浸泡5 min，無菌取出脾臟，剪碎，再轉入5 ml玻璃勻漿器中仔細研磨，過200目細胞篩并制成細胞懸液，用PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，重復兩次。再用完全培養液調濃度為5×106個/ml。將調整好濃度的細胞懸液加入96孔細胞培養板(每孔100μl)，設3個重復。每只小鼠脾細胞懸浮液分為3組，一組加5μl(濃度為0.1 mg/ml)Con A 液，一組加10 μl(濃度為0.1 mg/ml)LPS液，一組不做處理。置37℃、5%CO2培養箱培養44 h，加入5 mg/ml的 MTT液10 μl，振搖，繼續培養4 h后取出，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加DMSO(每孔100μl)，振蕩，用酶標儀在波長550 nm處測OD值。淋巴細胞的增殖能力分別用加Con A和LPS孔的光密度值減去不加Con A和LPS孔的光密度值表示。

1.7 小鼠巨噬細胞功能的測定 末次給藥后1 h，于鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(生理鹽水稀釋3倍)0.1 ml/10 g，注射后 2 min、10 min 分別從小鼠的左眼靜脈叢和右眼靜脈叢取血20μl，加入0.1%Na2CO3溶液 2.0 ml中，搖勻，以 0.1%Na2CO3溶液做空白對照。用酶標儀在波長600 nm下比色，測定其OD值。將小鼠稱重，處死，取肝、脾稱重，按下列公式計算出碳廓清指數κ和吞噬系數α:κ=(logOD1-logOD2)/(t1-t2);α =κ1/3×W/WLS，式中OD1、OD2分別為 2 min、10 min 時，取血測得的吸光度值，t1、t2為注射印度墨汁后采血的時間，W為體重，WLS為肝+脾合重。

1.8 統計學分析 所有實驗數據以x±s表示，應用SPSS10.0統計學軟件進行數據統計，多組均數比較用單因素方差分析。P＜0.01認為有顯著的統計學意義，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 給藥期間各組動物一般情況 結果見表1。

2.2 “益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響 由表2可以看出，模型組和參一膠囊組的血清IL-2含量明顯低于正常組，而“益元抑瘤湯”組的血清IL-2含量顯著升高，與模型組比較具有顯著的統計學差異(P＜0.01);模型組、參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的血清TNF-α含量均明顯高于正常組，與模型組比較，參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 “益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖的影響 由表3可知，模型組的T、B細胞轉化能力均低于正常組，參一膠囊陽性對照組和“益元抑瘤湯”組小鼠的T、B細胞轉化能力均高于正常組，與模型組比較，參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組差異均具有顯著的統計學意義(P＜0.01)。

表1 “益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠體重、精神的影響Tab.1 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on weight and mental state in H 22 tumor-burdened mice

表2 “益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表2 “益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響(± s，n=10)Tab.2 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the contents of IL-2 and TNF-αin H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜ 0.01.

Group n IL-2(pg/ml) TNF-α(μg/ml)NC 10 82.71 ±13.01 1.12 ±0.13 MC 10 63.96 ±3.603) 1.45 ±0.173)Rg3 10 68.13 ±6.253) 1.67 ±0.231)3)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 80.62 ±12.502) 2.11 ±0.282)3)

表3 “益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖的影響± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

表3 “益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖的影響± s，n=10)Tab.3 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the T and B cell proliferation in H 22 tumor-burdened mice(±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜ 0.01;Compared with normal control，2)P ＜0.05.

Group n T lymphocytes(OD) B lymphocytes(OD)NC 10 0.191 ±0.040 0.192 ±0.060 MC 10 0.155 ±0.0252) 0.158 ±0.014 Rg3 10 0.230 ±0.0111)2) 0.230 ±0.0111)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.217 ±0.0111) 0.223 ±0.0121)

表4 “益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠巨噬細胞功能的影響± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

表4 “益元抑瘤湯”對H 22荷瘤小鼠巨噬細胞功能的影響± s，n=10)Tab.4 Effect of“Yiyuan Yiliu Tang”on the function of macrophages in H 22 tumor-burdened mice±s，n=10)

Note:Compared with model control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with normal control，3)P ＜0.01.

Group n The carbon clearance index(κ)Predominate consume coefficient(α)NC 10 0.021 ±0.002 4.95 ±0.32 MC 10 0.027 ±0.0093) 4.89 ±0.18 Rg3 10 0.026 ±0.0063) 5.08 ±0.261)“Yiyuan Yiliu Tang” 10 0.036 ±0.0091)3) 5.60 ±0.352)3)

2.4 “益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠巨噬細胞功能的影響 由表4可以看出，模型組、參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的碳廓清指數κ均顯著高于正常組，與模型組比較，“益元抑瘤湯”組差異有顯著性(P＜0.05);參一膠囊組和“益元抑瘤湯”組的吞噬系數α均高于正常組，并且與模型組的差異均具有統計學差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3 討論

機體抗腫瘤的免疫機制十分復雜，抗腫瘤免疫效應一般以細胞免疫為主，但對病毒誘發的腫瘤，體液免疫亦起到十分重要的作用。腫瘤的存在不僅抑制機體的細胞免疫，同時也抑制體液免疫。因此，提高腫瘤患者的免疫功能，成為抗腫瘤治療的一個主要方面［5］。本文中“益元抑瘤湯”給藥期間小鼠體重增加均勻，飲食、飲水量正常，小鼠比較活躍，毛色有光澤，精神狀態良好，無明顯副作用，可以通過調節自身的免疫功能，達到“帶瘤生存”的目的。

白細胞介素2(IL-2)是由活化T細胞產生的多功能免疫應答調節劑，其最重要的作用是誘導T淋巴細胞增殖(從G0期進入S期)和分化。IL-2能增強CD8+、CTL的殺傷活性，誘導其IL-2受體的表達，同時誘導各效應細胞分泌 IL-4、TNF、CSF等細胞因子［6］。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用特強的生物活性因子之一［7］。在本研究中，“益元抑瘤湯”能顯著升高H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α含量，說明“益元抑瘤湯”通過增加H22荷瘤小鼠體內IL-2、TNF-α的分泌促進機體免疫。

T細胞通過細胞毒的直接殺腫瘤作用而抑瘤，或者分泌與腫瘤有關的細胞因子，如白細胞介素2(IL-2)、干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)等，形成細胞因子網，并通過網絡內外的因子之間與細胞間的相互作用，共同殺傷腫瘤細胞［8］。B細胞為T細胞非依賴性細胞，在抗原刺激下可分化為漿細胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要執行機體的體液免疫。本實驗表明:“益元抑瘤湯”組小鼠的T、B淋巴細胞轉化能力均顯著高于模型對照組，說明“益元抑瘤湯”對H22荷瘤小鼠脾臟T、B細胞增殖均具有促進作用。

巨噬細胞(M)是腫瘤免疫中的重要效應細胞，它在誘導特異性體液免疫和細胞性抗腫瘤免疫應答中占有重要地位，屬于非特異性免疫［9］。它可以通過直接吞噬外來抗原或直接與瘤細胞結合而發揮殺瘤效應;也可以分泌某些產物抑制腫瘤的生長;還可以通過ADCC作用殺傷腫瘤［10］。“益元抑瘤湯”組的碳廓清指數κ和吞噬系數α均高于模型組，說明“益元抑瘤湯”能促進荷瘤機體免疫力的提高，可能通過以上某一途徑產生抑瘤作用。

綜上所述，“益元抑瘤湯”能增加H22荷瘤小鼠體內 IL-2、TNF-α 含量;對H22荷瘤小鼠脾臟 T、B 細胞增殖和巨噬細胞的吞噬功能有明顯促進作用。“益元抑瘤湯”對荷瘤機體的免疫系統的影響達到了扶正祛邪的目的，顯示了中醫治療腫瘤的特色，有利于腫瘤機體的恢復。

［1］ 王艷杰，孫 陽，李明珠，等.五味子多糖對S180荷瘤小鼠紅細胞免疫抗腫瘤的作用［J］.天津醫藥，2011，39(9):824-827.

［2］ D Qiao，JLuo，C Ke，et al.Immunostimulatory activity of the polysaccharides from Hyriopsis cumingii［J］.Int J Biol Macromol，2010，47(5):676-680.

［3］ 郭紅云，張永東，胡清榮，等.扶正升血顆粒對荷瘤小鼠細胞免疫和體液免疫功能的影響［J］.甘肅醫藥，2009，28(5):347-349.

［4］ 徐叔云，卞如廉，陳 修.藥理實驗方法學［M］.第3版.北京:人民衛生出版社，2002，1756-1765.

［5］ 王 鑫，李 勇.人參類中藥對胃癌抑制作用的研究進展［J］.吉林中醫藥，2012，32(9):963-966.

［6］ 劉祥勝，劉開俊，楊業金.華蟾素對Hela細胞生長和小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的影響［J］.免疫學雜志，2005，21(3):132-135.

［7］ Chan HH，Sun HD，Reddy MV，et al.Potentα-glucosidase inhibitors from the roots of Panax japonicus C.A.Meyer var.major［J］.Phytochemistry，2010，71(12):1360-1364.

［8］ 熊 露，田少霞.扶正培本治則方藥調節腫瘤微環境免疫與血管正常化的思路研究［J］.中國中西醫結合雜志，2010，30(2):201-204.

［9］ Li TB，Zhang LX，Wu MJ，et al.Characterization and anti-tumor activity of alkali-extracted polysaccharide from Enteromorpha intestinalis［J］.Int Immunopharmacol，2009，9(3):324-329.

［10］ Katsiari CG，Liossis SC，Sfikakis PP.The pathophysiologic role of monocytes and macrophages in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheu，2010，39(6):491-503.