DC 對系統性白假絲酵母菌感染保護性研究①

徐美蘭 劉金星 陳美任 (嘉應學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院，梅州 514031)

近年來白假絲酵母菌在醫(yī)院感染中成為最常見的條件致病性真菌。臨床上隨著體內治療裝置的植入及器官移植等使白假絲酵母菌感染率不斷上升，深部白假絲酵母菌感染病死率高達40%［1-3］。其主要原因是目前用于治療真菌的藥物數量有限且部分真菌已產生耐藥。所以研發(fā)有效的疫苗對白假絲酵母菌感染防治具有重要意義。

DC 作為體內最重要的抗原提呈細胞(APC)，其表面多樣性的受體是其識別并捕捉各種形態(tài)真菌的物質基礎，具有強大的提呈抗原作用和啟動初始T 細胞的能力。DC 通過細胞表面的甘露糖-巖藻糖等受體［4］，識別和吞噬念珠菌，然后到達組織引流次級淋巴器官，分化成成熟的DC，從而有效地啟動T 細胞增殖和分化。

在系統性白假絲酵母菌感染過程中，體液免疫和細胞免疫應答都發(fā)揮了重要的防御作用。本課題組將致敏的DC 免疫小鼠，觀察其對系統性白假絲酵母菌感染的保護效果的研究，現總結如下。

1 材料與方法

1.1 白假絲酵母菌標準菌株ATCC14053(均由本實驗室儲存)。KM 系小鼠:5～6 周齡約30 g，購于汕頭大學動物實驗中心(合格證號:SCXK2012-0017)。小鼠DC2.4 細胞(DC 細胞來源于小鼠骨髓)、IL-4、IFN-αmouse ELISA 試劑均購于上海希爾頓有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白假絲酵母菌孢子與菌絲混合液致敏小鼠DC 白假絲酵母菌于沙堡培養(yǎng)基純培養(yǎng)48 h，菌液濃度調至5 ×105ml-1;取沙堡培養(yǎng)基上白假絲酵母菌轉種于YPD 液體培養(yǎng)基，置搖床振蕩培養(yǎng)48 h，離心棄上清，加入含小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基，調菌數為5 ×105ml-1，置37℃水浴箱培養(yǎng)3 h，得菌絲相白假絲酵母菌［5］。將上述白假絲酵母菌孢子液與菌絲液相等量混合，以2 倍于DC數的白假絲酵母菌孢子混合液與小鼠DC 混合，37℃孵育1 h，牛血清白蛋白梯度離心后收集分界層細胞［6］，PBS 洗滌2 次，調DC 濃度為1 ×106ml-1置于冰浴上。每次取100 μl 小鼠尾靜脈注射。

1.2.2 動物試驗 小鼠隨機分為2 組，每組10 只。DC 組為預處理DC 100 μl 與福氏完全佐劑等體積混合物，分別于第1 天、第7 天及第14 天經尾靜脈注射，對照組注射等量PBS。環(huán)磷酰胺具有免疫抑制作用，經動物試驗得80 mg/kg 造系統性白念珠菌感染小鼠模型效果較佳。免疫接種后各組小鼠接受免疫抑制劑給予環(huán)磷酰胺80 mg/kg，背部皮下注射，連續(xù)2 d;再用菌量為0.2 ml×106ml-1的白假絲酵母菌孢子及菌絲混懸液經尾靜脈注射形成系統性白假絲酵母菌感染動物模型［7］，觀察小鼠生存期、腎臟做病理切片，眼球取血送廣州華銀檢驗中心檢測CD4+、CD8+，取血清按試劑說明書檢測IL-4 及IFN 水平。

2 結果

2.1 生存期及CD4+、CD8+、IL-4、IFN-α 檢測 對照組小鼠第1 天(d)死亡2 只，至第3 d 內全部死亡;DC 組3 d 死亡1 只，第7 天死亡4 只，其余存活至觀察期結束。經Kaplan-Meier 分析，對照組和DC組間有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表1。

2.2 小鼠腎病理切片 DC 組腎小球輕度水腫，鏡下可見少量白細胞及紅細胞，未見管型;對照組水腫充血較明顯，鏡下可見大量紅細胞、白細胞，可見白細胞管型，腎小球結構不完整。詳見圖2。

表1 小鼠生存時間與生存狀況及CD4 +、CD8 +百分比，白細胞介素4，干擾素α 統計學分析Tab.1 Analysis of survival time and living condition of mouse，percentage of CD4 +CD8 +and IL-4，IFN-α

圖1 CD4 +CD8 +流式檢測結果Fig.1 FCM result of CD4 +CD8 +

圖2 小鼠腎病理切片Fig.2 Kidney pathological section of mouse

3 討論

白假絲酵母菌是二相性真菌，其孢子和菌絲相致病力及侵襲力各不相同，因此本試驗采用兩者的混合液致敏小鼠DC。DC 對雙相白假絲酵母菌具有極強的可塑性，可以識別不同形態(tài)、不同表面標志而表現出不同的生物學特性［9］。在念珠菌感染中，不同狀態(tài)的白假絲酵母菌能夠以不同途徑進入DC［10］。酵母狀態(tài)的白色念珠菌被吞噬后，在細胞內形成吞噬溶酶體，DC 分泌NO 和IL-12，調節(jié)CD4+Th 細胞向Th1 型分化，在體內產生有效的抗真菌反應;而菌絲體狀態(tài)的白色念珠菌通過傳統的拉鏈途徑被吞噬入胞，會裂解體膜，躲避在細胞漿中。本實驗將致敏的DC 接種免疫小鼠，當DC 在小鼠體內再次接觸白假絲酵母菌根據“免疫記憶”可迅速進行免疫應答反應。

DC 在抗感染免疫中的作用十分獨特，其既是固有免疫的第一道防線(識別、吞噬)，又是獲得性免疫的始動者(對不同免疫方向的誘導)，主要誘導CD4+T(Th1、Th2)和CD8+T 淋巴細胞的活化［10-12］。機體抗白念珠菌的免疫機制包括固有免疫和獲得性免疫，因此，應選擇既能誘導細胞免疫又能誘導體液免疫的物質作為候選疫苗。本項目中實驗組與對照組的生存期有顯著性差異，說明DC 在抵抗系統性白假絲酵母菌感染發(fā)揮著重要的作用，這與小鼠腎病理切片觀察結果相符，即DC 能有效保護白假絲酵母菌對小鼠腎小球的損傷。CD4+T 細胞是MHCⅡ類抗原限制的細胞群，CD8+T 細胞是MHCⅠ類抗原限制的細胞群。無論CD4+還是CD8+T 細胞均具有增強T 淋巴細胞免疫功能。實驗組與對照組CD4+、CD8+相比均顯著性升高，說明致敏的DC對系統性白假絲酵母菌感染誘發(fā)了有效而足夠的保護性免疫反應。與自然免疫比較，體外抗原致敏后的人工過繼免疫能避免抗原與抗原提呈細胞相遇機遇小、誘發(fā)免疫的方向難以控制的不足。

根據CD4+Th 細胞分泌細胞因子的類型，可分為Th1 和Th2 兩個亞群。CD4+Th 通過分泌細胞因子，移動和活化效應細胞和分子。在系統性真菌感染中T 淋巴輔助細胞1(Th1)類因子如白細胞介素(IL-12)、干擾素α(IFN-α)介導的細胞免疫對機體起保護作用，而Th2 類細胞因子如IL-4、IL-10 等可削弱小鼠抗系統性真菌感染的能力［13］。IFN-α 既可作為前炎因子誘導IL-12 的分泌，促進Th0 細胞向Th1 細胞的定向分化;又可作為效應因子，活化巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞，促進單核細胞的循環(huán)，是機體抗白念珠菌感染的保護性因子。在本實驗中IFN-α 水平的高低是致敏DC 誘導小鼠抗系統性白假絲酵母菌免疫的重要指標，IL-4 的水平作為小鼠白念珠菌感染非保護性免疫的指標。結果顯示致敏DC 組IFN-α 含量較菌絲相組及對照組明顯增高，IL-4 含量變化則與之相反。再次證明了致敏DC 對系統性白假絲酵母菌感染的免疫保護價值。有理由相信隨著相關研究的不斷深入，DC 疫苗或以DC 為佐劑將會在抗白假絲酵母菌感染免疫中起到越來越重要的作用。

［1］Snydman DR.Shifting patterns in the epidemiology of nosocomial Candida infections［J］.Chest，2003，123 (5 Suppl):500S-503S.

［2］Sendid B，Cotteau A，Fran?ois N，et al.Candidemia and antifungal therapy in a French University Hospital:rough trends over a decade and possible links［J］.BMC Infect Dis，2006，6:80-89.

［3］San Miguel LG，Cobo J，Otheo E，et al.Secular trends of candidemia in a large tertiary-care hospital from 1988 to 2000:emergence of Candida parapsilosis［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2005，26:548-552.

［4］Romani L，Mencacci A，Cenci E，et al.Neutrophils and the adaptive immune response to Candida albicans［J］.Res Immunol，1996，147:512-518.

［5］周村建，郝 飛，王 魯，等.白假絲酵母菌菌絲的誘導培養(yǎng)［J］.第三軍醫(yī)大學報，2004，26(9):832-833.

［6］Bozza S，Gaziano R，Spreca A，et al.Dendritic cells transport conidia and hyphae of Aspergillus fumigatus from the airways to the draining lymph nodes and initiate disparate Th responses to the fungus［J］.J Immunol，2002，168(3):1362-1371.

［7］楊 瓊，宋祥福，王桂云.系統性白色念珠菌感染小鼠動物模型的研究［J］.東北師范大學學報自然科學版，2005，2(37):86-89.

［8］Mosser DM，Karp CL.Receptor mediated subversion of macrophage cytokine production by intracellular pathogens［J］.Curr Opin Immunol，1999，11(4):406-411.

［9］Mencacci A，Montagnoli C，BacciA，et al.CD80+Gr-1+myeloid cells inhibit development of antifungal Th1 immunity in mice with candidiasis［J］.J Immunol，2002，169(6):3180-3190.

［10］Shoham S，Levitz SM.The immune response to fungal infections［J］.Br J Haematol，2005，129(5):569-582.

［11］LeBlanc DM，Barousse MM，Fidel PL Jr.Role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis［J］.Infect Immun，2006，74(6):3213-3221.

［12］De Bernardis F，Lucciarini R，Boccanera M，et al.Phenotypic and functional characterization of vaginal dendritic cells in a rat model of Candida albicans vaginitis［J］.Infect Immun，2006，74(7):4282-4294.

［13］Mosser DM，Karp CL.Receptor mediated subversion of macrophage cytokine production by intracellular pathogens［J］.Curr Opin Immunol，1999，11(4):406-411.