細胞外信號調節蛋白激酶5 / 凋亡調節蛋白信號途徑在低溫誘導心肌細胞損傷及凋亡中的調控作用

王耀晟， 程曉曙， 洪葵 ，吳宗貴， 李毅剛

人體正常核心體溫保持在36.6～37.6 ℃，暴露于極端寒冷時，體內核心溫度穩態被破壞[1]，刺激交感神經，影響血管收縮，造成血壓、心率波動，誘導血小板活化、促進血栓形成[2]。低溫誘導心肌損傷的細胞和分子生物學機制仍不完全清楚。體外研究報告發現低溫刺激加速心肌細胞（CMs）凋亡[3]。凋亡的機制涉及許多方面，如線粒體膜通透性、細胞內活性氧簇（ROS）和鈣離子水平等[4]。線粒體膜電位（ΔΨm）破壞可導致電子傳遞鏈中斷，停止氧化磷酸化，并增加細胞內活性氧，從而促進細胞損傷[5]。細胞內鈣超載，也可導致異常線粒體氧化磷酸化，造成細胞的不可逆的損害[6]。故此本研究探討了低溫刺激誘導的心肌細胞損傷與線粒體途徑細胞凋亡、ROS爆發，以及細胞內鈣超載的關聯性。凋亡調節蛋白Bim是Bcl-2家族中的促凋亡成員，其在各個器官中廣泛表達[7]。在不同類型細胞中，Bim的轉錄水平、亞細胞定位和磷酸化形式各不相同[8]。目前，Bim在低溫刺激引起心肌細胞凋亡中的具體機制不明。研究發現Bim的上游存在調控物質，可能與細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）傳導通路有關。抑制ERK可產生Bim的上調效應[9]。而同屬絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）亞家族成員的ERK5是否參與其中，少見報道。本研究著重探討ERK5 / Bim途徑在低溫誘導心肌細胞損傷及凋亡中的調控作用。

1 材料與方法

實驗動物與材料：2012-01至2012-12選擇新生1～2天的sprague dawley（SD）乳鼠（中國科學院上海實驗動物中心，合格證號: 中科院動管會第005號）。改良Eagle 培養基（ DMEM） 、胎牛血清、胰蛋白酶 （美國Gibco 公司） ，培養皿（ 美國Corning公司），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，美國Sigma 公司），脂質體轉染試劑盒（美國Invitrogen公司），蛋白抽提試劑盒（武漢博士德公司）。羊抗鼠 Bim EL抗體、ERK5抗體、p-ERK5抗體（北京愛迪博公司），β-肌動蛋白（β-actin內參照）抗體和抗山羊活化辣根過氧化物酶-IgG抗體（美國Santa Cruz 公司），化學發光試劑盒（英國Amersham公司）。膜聯蛋白V- 熒光素 /碘化丙啶（Annexin V-FITC / PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國 BD Pharmingen公司）。鈣離子熒光（Fluo-3AM）探針（北京泛博生化公司）。 6 -羧基-2', 7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（6-carboxy-H2DCFHDA）、5, 5', 6, 6'- 四氯 - 1, 1, 3, 3'- 四乙基苯并咪唑-硫雜羰花青碘化物（JC-1，美國Invitrogen公司）。

原代心肌細胞培養：乳鼠浸泡在70%酒精內麻醉處死。取心室組織溫浴PBS溶液洗滌后剪碎，以0.25%胰蛋白酶在37℃溫浴消化10分鐘。加入含10%胎牛血清DMEM終止消化。棄上清液后加入0.25%胰蛋白酶在37℃溫浴消化15分鐘，收集上清液。上述消化步驟重復四次。收集所有上清液室溫下1500 轉/分鐘離心10分鐘，細胞重懸后以 5×104cells/cm2密 度 鋪 皿 培 養， 加 入 0.1 ml/ L BrdU。 24小時后換液備實驗用。

小干擾RNA干預：針對大鼠Bim的siRNA購自美國Sigma公司（參考序列編號：NM_022612）。大鼠ERK5特異性siRNA設計序列如下：＃1：5'-CAGUCACUUGUGCCACCUATT-3'＃ 2：5'-GGAGGAAUUCUUAAACCAATT-3';＃ 3：5'-GGCCCUGUAUCUCAGACUATT-3'（參考序列編號：NM_002749）。胰蛋白酶消化心肌細胞，接種于60毫米規格平皿，培養24小時后轉染siRNA。使用脂質體為轉染介質，以非編碼siRNA作為對照。轉染 48小時后，用于低溫刺激干預。

低溫刺激干預：低溫刺激設定為：細胞置于35℃、5%CO2細胞培養箱，每天8小時，共干預4天（共計32小時的低溫刺激）。低溫刺激外的時間，細胞置于正常培養條件下（37℃，5%CO2）。對照組設定為正常37℃，5%CO2條件中全程培養4天。

實驗分組：對照組；低溫刺激組；低溫刺激加非編碼siRNA即陰性對照組；低溫刺激加Bim siRNA組（加Bim組）；低溫刺激加ERK5 siRNA組（加ERK5組）；低溫刺激加ERK5 siRNA、Bim siRNA共轉染組（共轉染組）。所有實驗檢測均重復3次。

蛋白質的提取和免疫印跡分析：胰酶消化法收集各實驗組細胞，蛋白提取遵試劑盒說明書。通過蛋白定量分析儀（德國Eppendorf公司）進行蛋白定量，-20℃儲存蛋白樣本用于免疫印跡分析（Western blot）。總蛋白提取物以8%凝膠電泳后半干轉至硝酸纖維素膜，予以1:200稀釋的BimEL、ERK5 / 磷酸化ERK5抗體，1:2000稀釋的β-肌動蛋白抗體孵育過夜。TBST緩沖液洗膜，室溫下以1:10000稀釋的抗山羊IgG-HRP孵育60分鐘。TBST緩沖液洗滌后，暴露于化學發光試劑，曝光膠片。條帶量化分析使用Image J軟件（美國國立衛生研究院）。

細胞凋亡檢測：采用 Annexin V-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒，以流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞凋亡。Annexin V-FITC可識別細胞凋亡， PI作為非特異性的DNA染料，可結合非存活細胞。Annexin V-FITC陽性細胞總百分比視為總細胞凋亡率。

細胞內鈣離子水平檢測：以 5 μmol/ L Fluo-3AM 加載細胞，在37℃孵育30分鐘，488 nm氬激光流式細胞術進行檢測（美國BD公司）。記錄1×104個事件，計算熒光強度。細胞內鈣離子水平的數值計算公式為：[Ca2+]i（nmol / L）= KD（F-F）/（Fmax-F）。Kd=400 nmol / L。Fmax為加入鈣離子載體后的測量值，Fmin為加入鈣離子螯合劑乙二胺四乙酸后的測量值[10]。

ROS檢測：6 - 羧基 H2DCFHDA 作為細胞滲透性染料，可被活性氧氧化成高度熒光物質，用以測量各組細胞內ROS[11]。熒光測定條件設定為在488 nm激發，測量值單位表示為AU。

線粒體膜電位檢測：線粒體膜電位（ΔΨm）通過JC-1染料結合流式細胞儀檢測。 JC-1可聚集在完整的線粒體，發出明亮的紅色熒光。線粒體膜電位中斷時， JC-1染料聚集受到抑制，以單體形式保持在細胞質中，發出綠色熒光。 37℃下使用 10 μg/ml JC-1孵育細胞15分鐘。熒光顯微鏡下觀察紅色和綠色熒光。重懸細胞后通過流式細胞儀進行熒光強度分析。

統計分析：數據均表示為平均值±標準差，進行單向方差分析（ANOVA）。方差不齊時使用秩和檢驗。P＜0. 05 認為差異有統計學意義。統計圖表由GraphPad Prism 4.0 軟件生成。

2 結果

與對照組比較，低溫刺激組、加ERK5組、陰性對照組的Bim蛋白表達明顯增加（低溫刺激組：1.04±0.09，加ERK5組：1.54±0.14，陰性對照組：1.04±0.08 vs 對照組：0.24±0.03），差異有統計學意義（P＜0.01）。 與低溫刺激組比較，加ERK5組Bim蛋白表達明顯增加（低溫刺激組：1.04±0.09 vs 加 ERK5 組：1.54±0.14，P＜0.05），差異有統計學意義（圖1A）。低溫刺激組與對照組比較，心肌細胞的ERK5蛋白表達無明顯差異，但磷酸化ERK5蛋白表達增高（低溫刺激組：0.84±0.05 vs 對照組 0.41±0.02，P＜0.01），差異有統計學意義（P＜0.01）。低溫刺激組與加Bim組比較， Bim siRNA不影響ERK5表達，但磷酸化ERK5蛋白表達減低（低溫刺激組：0.84±0.05 vs 加Bim組：0.49±0.03，P＜0.01）,差異有統計學意義。圖1B

圖1 在低溫刺激干預下的心肌細胞中，ERK5 siRNA對Bim蛋白表達的影響（1A），以及Bim siRNA對ERK5 / p-ERK5蛋白表達的影響(1B)

細胞凋亡率檢測示低溫刺激組比對照組凋亡率明顯增高[低溫刺激組：（32.45±2.01）% vs 對照組：（9.08±1.46）%，P＜0.01]。 Bim siRNA緩解低溫刺激誘導的心肌細胞凋亡，加Bim組比低溫刺激組明顯減低 [加 Bim 組：（15.88±1.02）% vs 低溫刺激 組 :（32.45±2.01）%，P＜0.01]， 而 加 ERK5組的ERK5 siRNA導致凋亡率比低溫刺激組進一步增高[加ERK5組：（41.30±4.21）%vs 低溫刺激組:（32.45±2.01）%，P＜0.01]。Bim siRNA 可取消 ERK5 siRNA的促凋亡作用，加ERK5組比共轉染組明顯降低[加ERK5組：（41.30±4.21）% vs 共轉染組：（27.01±2.82）%，P＜0.05]，差異均有統計學意義。圖2

低溫刺激下的心肌細胞內存在鈣離子超載，低溫刺激組明顯高于對照組[低溫刺激組：（625±27）nmol / L vs 對照組：（361± 52） nmol/L，P＜0.01]。Bim siRNA減弱低溫刺激誘導的細胞內鈣離子超載，加Bim組明顯低于低溫刺激組[加Bim組：（469±33）nmol/L vs 低溫刺激組：（625±27） nmol/L，P＜0.05]。ERK5 siRNA則加重低溫刺激誘導的細胞內鈣離子超載，加ERK5組明顯高于低溫刺激組[加ERK5組：（1154±56）nmol/L vs 低溫刺激組：（625±27） nmol/L，P＜0.01]。Bim siRNA 可代償 ERK5 siRNA 的鈣離子超載效應，共轉染組明顯低于加ERK5組[共轉染組：（673±59） nmol/L vs 加 ERK5 組：（1154±56） nmol/L，P＜0.01]，差異均有統計學意義（圖3）。非編碼siRNA對細胞內鈣離子水平無影響。

低溫刺激在心肌細胞中誘導ROS水平增高，低溫刺激組明顯高于對照組（低溫刺激組：10.08±0.85 vs 對 照 組：3.61±0.71，P＜0.01 ），Bim siRNA 可抑制此低溫誘導的ROS爆發，加Bim組明顯低于低溫刺激組（加 Bim 組：4.82±0.48 vs 低溫刺激組：10.08±0.85，P＜0.01）。 ERK5 siRNA 誘 發 更 嚴 重的ROS激活，加ERK5組明顯高于低溫刺激組（加ERK5 組：18.34±1.22 vs 低 溫刺 激組：10.08±0.85，P＜0.01）， Bim siRNA 則可緩解 ERK5 siRNA 對 ROS活性的增強，共轉染組明顯低于加ERK5組（共轉 染 組：10.02±0.87 vs 加 ERK5 組：18.34±1.22，P＜0.01），差異均有統計學意義。圖4

圖2 ERK5 siRNA以及Bim siRNA 對低溫刺激下心肌細胞凋亡的影響。流式細胞散點圖（2A）；各組凋亡率（2B）

圖3 ERK5 siRNA以及Bim siRNA 對低溫刺激下心肌細胞內鈣離子超載的影響。余注見圖1

圖4 ERK5 siRNA以及Bim siRNA對低溫刺激下心肌細胞內活性氧活動的影響。余注見圖1

心肌細胞線粒體膜電位在低溫刺激下受到破壞，低溫刺激組明顯低于對照組（低溫刺激組：51.32±5.57 vs 對 照 組：83.29±7.2，P＜0.01），Bim siRNA可恢復低溫刺激損害的ΔΨm，加Bim組明顯高于低溫刺激組（加Bim組：69.26±7.13 vs 低溫刺激組：51.32±5.57，P＜0.01），ERK5 siRNA誘導更嚴重的ΔΨm破壞，加ERK5組明顯低于低溫刺激組（加ERK5組：30.42±8.32 vs 低溫刺激組：51.32±5.57，P＜0.01），而 Bim siRNA可代償ERK5 siRNA對ΔΨm的破壞，共轉染組明顯高于加 ERK5組（共轉染組：47.18±5.11 vs 加ERK5 組：30.42±8.32，P＜0.01 ）。圖 5

圖5 ERK5 siRNA以及Bim siRNA對低溫刺激下心肌細胞內線粒體膜電位的影響。余注見圖1

3 討論

低體溫一般指身體核心溫度低于35℃，是對人類機體存在潛在危害的病理狀態[12]。 低溫刺激對心臟的損害作用已被廣泛報道，心肌細胞損傷及凋亡是重要環節。研究表明極短時間的低溫預處理可緩解心肌缺血再灌注損傷，提高再灌注期間心臟泵功能，發揮抗心律失常作用[13]，提示低溫刺激并非誘導心肌細胞迅速壞死，而是緩慢的細胞凋亡。本研究證實了低溫刺激下心肌細胞以凋亡為主，而非細胞完全死亡。

低溫刺激在亞細胞水平產生多方面的病理變化。作為氧代謝水平極高的細胞種類，心肌細胞可產生一系列 ROS ，過高水平的ROS誘導細胞氧化應激，導致細胞損傷。有研究報道，低溫刺激可使離體灌流心臟中的活性氧水平增高，并由此損害心肌細胞線粒體生物能[14]。此外，心肌細胞內鈣超載可導致：線粒體氧化磷酸化障礙；線粒體膜電位下降；ATP代謝水平降低；細胞質磷脂酶和蛋白酶激活，這些均可導致不可逆轉的細胞損害[15]。故此，ROS爆發，Ca2+超載和線粒體膜電位的破壞之間存在并發關系。本研究證實ROS爆發與細胞內鈣超載均參與低溫刺激誘導的心肌細胞損傷，同時證實了線粒體膜電位損壞，在低溫刺激誘導心肌細胞損傷發揮重要作用，并與前述的低溫誘導心肌細胞內鈣離子超載趨勢相吻合。

研究報道ERK與B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）家族通過線粒體途徑密切參與細胞凋亡激活[16]。本研究在低溫刺激下的心肌細胞中檢測到明確的Bim蛋白高表達。通過RNA干擾技術我們下調Bim表達，獲得細胞凋亡率降低、ROS水平減低、鈣超載和線粒體膜電位破壞緩解等效應。結果高度提示Bim作為促凋亡蛋白在低溫誘導的心肌細胞凋亡及損傷中發揮重要作用。我們同時發現低溫刺激下的心肌細胞中，ERK5以及磷酸化的ERK5 存在高表達，下調Bim可抑制ERK5磷酸化并起保護性作用，緩解細胞凋亡、ROS爆發、細胞內鈣超載以及線粒體膜電位障礙。下調ERK5則促進Bim蛋白表達，并加重上述低溫誘導的一系列亞細胞水平損傷。結果充分體現了ERK5作為Bim上游抑制物的作用，以及ERK5 / Bim間存在負反饋關系。

綜上所述，在低溫刺激下的心肌細胞中，下調ERK5可釋放對Bim的表達抑制，誘導更高的細胞凋亡率，以及更嚴重的細胞內鈣離子超載、ROS活動、線粒體膜電位損傷。下調Bim則發揮反向的保護性作用。結果顯示ERK5/ Bim途徑在低溫刺激誘導心肌細胞損傷中的明確調控作用。

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