依那普利對壓力超負荷誘導的心肌纖維化的影響及microRNA-214的表達變化

王東 魏文平 王芳

依那普利對壓力超負荷誘導的心肌纖維化的影響及microRNA-214的表達變化

王東 魏文平 王芳

目的 探討壓力超負荷導致心肌纖維化過程中microRNA-214的表達變化，以及依那普利對心肌纖維化的影響。方法 80只雄性SD大鼠隨機分為壓力超負荷組（Model，n=40），假手術組（Sham，n=40）。其中各組再隨機分為兩個亞組：依那普利治療組（n=20）與無依那普利治療組（n=20）。行腹主動脈縮窄術建立心臟壓力超負荷大鼠模型。4周后，酶聯免疫分析法測定各組大鼠血清中的PICP、ICTP、MMP-2、TIMP-2等心肌纖維化指標，熒光實時定量PCR技術檢測的microRNA-214表達變化。結果 壓力超負荷組大鼠的PICP為(161.3±16.3)ng/L、ICTP為(3.06±0.5)、PICP/ICTP 比值為(51.1±7.3)、MMP-2為(2638.2±289.6)pg/mL、TIMP-2為(4396±365.9)ng/mL，上述指標與假手術相比，均有所增高，差異具有統計學意義(P均<0.05)；模型組MMP-2/TIMP-2比值為(0.6±0.4)，顯著低于假手術組（P<0.05），依那普利處理亞組的大鼠PICP為(114.1±19.6)ng/L、ICTP為(2.5±0.7)ng/ L、PICP/ICTP比值為(45.1±16.3）、MMP-2為(806.8±301.6)pg/mL、TIMP-2為(2052.6±322.3)，均低于單純壓力超負荷組，異具有統計學意義（P均<0.05）。依那普利處理亞組MMP-2/TIMP-2比值為(0.88±0.3)，顯著高于單純壓力超負荷組，差異具有統計學意義(P均<0.05)。同時壓力超負荷處理會導致microRNA-214的表達相對于假手術組增高（2.1±0.3）倍，依那普利處理可以緩解壓力超負荷引起的microRNA-21過表達，但仍為假手術組的（1.5±0.2）倍。結論 依那普利可以緩解壓力超負荷造成的心肌纖維化，microRNA-214與此過程有關，可作為心肌纖維化的治療靶點或標志物。

壓力超負荷；大鼠；依那普利；心肌纖維化；微小RNA-214

心肌纖維化是指心肌細胞外的基質大量沉積，膠原濃度和膠原容積(collagen volume fraction，CVF)顯著增加，各型膠原代謝、排列紊亂，心肌纖維化影響心肌組織的結構和功能，如造成心肌肥厚，順應性降低，舒縮功能障礙，它是心室重構的表現，心房顫動的誘因，最終導致心衰、心律失常[1]。由高血壓等疾病引起心臟壓力超負荷是心肌纖維化的主要原因，其機制為心臟壓力超負荷可導致一系列的級聯信號的瀑布激活，從而誘發膠原代謝障礙，但是該機制十分復雜，涉及分子眾多，如能更加明確該機制，可為對抗壓力超負荷導致的心肌纖維化提供治療靶點[2]。近年來，除膠原代謝方面的機制得到了大量研究外，一些膠原代謝中的因子可以作為心肌纖維化的明確指標，如Ⅰ型前膠原羧基端肽（procollagen type I C-terminal peptide,PICP）、Ⅰ型膠原羧基端交聯肽（Type I collagen cross-linked telopeptide, ICTP）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基質金屬蛋白酶-2抑制劑(metallopeptidase inhibitor 2,TIMP-2)等[3]。此外，microRNA的研究也成為了研究熱點，有研究發現microRNA-214在心肌缺血/缺氧損傷中存在高表達[4]，但其與壓力超負荷導致的心肌纖維化是否有關還未見報道。大量研究已證實血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)類的藥物可以減輕心肌纖維化、減少心室重構、改善心力衰竭預后[5]，本研究旨在結合上述膠原代謝指標，探索依那普利對壓力超負荷誘導的心肌纖維化的影響及microRNA-214在此過程中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 分組和處理方法 80只雄性SD大鼠（購自蘭州大學動物實驗中心）隨機分為壓力超負荷組（Model，n=40），假手術組（Sham，n=40）。其中各組再隨機分為2個亞組：依那普利治療組（n=20）與無依那普利治療組（n=20）。依那普利（江蘇制藥股份有限公司）使用劑量為10mg/(kg·d)，灌胃方式給藥，1次/d。壓力超負荷組行腹主動脈縮窄術以建立壓力超負荷模型。各組干預4周后處死，檢測各組纖維化指標以及microRNA-214的表達變化。

1.2 纖維化指標的檢測 大鼠處死后，立即打開胸腔，抽取3mL動脈血。酶聯免疫吸附試驗法檢測各組大鼠血清中的Ⅰ型前膠原羧基端肽（PICP）與Ⅰ型膠原羧基端交聯肽（ICTP）的濃度檢并計算PICP/ICTP比值。同時檢測血清基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-2抑制劑(TIMP-2)濃度。

1.3 檢測各組microRNA-214的表達變化 剪去心臟心室組織，冰上操作快速剪碎。用總RNA提取試劑盒（美國QIAGEN公司）提取組織中的總RNA，使用microRNA反轉錄試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司），按照所說明書構建反轉錄體系，將microRNA反轉錄為cDNA。使用GO Taq? qPCR Master Mix（普洛麥格（北京）生物技術有限公司）對cDNA進行擴增，體系參照說明書。使用2-△△CT法分析各組的miR-214的相對表達情況。

1.4 統計學方法 使用SPSS 18.0統計學軟件進行統計學分析，正態計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 相比假手術組，壓力超負荷模型組下大鼠PICP水平增高、ICTP增高、PICP/ICTP比值增高。對于壓力超負荷模型組來講，依那普利治療亞組血清PICP、PICP/ICTP的比值均顯著降低，與非依那普利的壓力超負荷模型組相比，差異具有統計學意義(P均<0.05)。假手術組兩亞組之間的PICP、PICP/ICTP的比值差異無統計學意義。同時，壓力超負荷模型組血清MMP-2水平、TIMP-2水平比假手術組顯著提高(P均<0.05)。對于壓力超負荷模型組來講，依那普利治療亞組血清MMP-2水平、TIMP-2水平均顯著降低，MMP-2/TIMP-2的比值增高。與非依那普利的壓力超負荷模型組相比，差異具有統計學意義(P均< 0.05)。假手術組各亞組的MMP-2水平、TIMP-2水平差異無統計學意義（見表1、表2）。

表1 各組大鼠PICP與ICTP血清水平

表2 各組大鼠MPP-2與TIMP-2血清水平

2.2 相比假手術組，壓力超負荷模型組的miR-214表達水平明顯提高，其中依那普利治療亞組的miR-214表達相對于假手術組的依那普利治療亞組提高了（1.5±0.2）倍，非依那普利治療亞組的miR-214表達相對于假手術組的非依那普利治療亞組提高了（2.1±0.3）倍。且差異均有統計學意義（P均<0.05）。假手術組中依那普利亞組的miR-214表達水平低于非依那普利亞組，差異有統計學意義（P<0.05，見圖1）。

圖1 各組大鼠miR-214的表達變化。注：Sham表示無依那普利治療的假手術組，Model表示無依那普利治療壓力超負荷組，Sham+ena表示依那普利治療的假手術組，Model+ena表示依那普利治療的壓力超負荷組。與無依那普利治療的假手術組相比，aP<0.05。與無依那普利治療的壓力超負荷亞組相比，bP<0.05

3 討論

壓力超負荷導致心肌纖維化是確定的事實，本研究通過構建模型，制造壓力超負荷條件后，檢測各種心肌纖維化指標，確實提示有心肌纖維化的發生。壓力超負荷可以通過激活多個因子及其涉及的信號通路來誘發心肌組織膠原代謝紊亂，引起心肌纖維化。這些因子或信號包括：EGR-1的表達、鈣調神經磷酸酶(CaN)信號通路、人體補體因子B的表達、Rho激酶信號通路[5-7]。而這些因子或信號通路都會受到善血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的激活，即血管緊張素Ⅱ的濃度從一定程度上來講會增加心肌的纖維化，而實際上確有研究表明心肌纖維化的過程中存在AngⅡ水平的增高[5]。因而AngⅡ可作為心肌纖維化的指標，同時從另一個角度考慮，抑制AngⅡ的水平也許可以減緩心肌的纖維化。依那普利是血管緊張素轉化酶抑制劑，可以降低AngⅡ的水平，本研究中，在壓力超負荷的情況下，纖維化指標提示出較為旺盛的膠原代謝，并出現了失衡，即膠原的合成要大于分解，而依那普利的使用一定程度上恢復了這種失衡，表明其降低了壓力超負荷造成的心肌纖維化。同時研究中發現，壓力超負荷會導致microRNA-214的表達增高，依那普利的使用，在心肌降低纖維化的同時，降低了microRNA-214的表達，這提示microRNA-214除了與缺血/缺氧損傷有關外，還參與心肌纖維的發展過程，其次提示microRNA-214與AngⅡ具有一定的聯系。microRNA-是一種微小RNA，微小RNA是真核生物中廣泛存在的一種長約21～23個核苷酸的單鏈RNA分子，可調節多種基因的表達，進而影響細胞的分化、凋亡等活動[8]，但本研究尚未闡明microRNA-214在心肌纖維化中的具體作用，這需要在進一步的研究中探索。總之，本研究證實了，依那普利可以緩解壓力超負荷造成的心肌纖維化，其機制microRNA-214的表達增高，microRNA-214可作為心肌纖維化的診斷指標或者治療靶點，但其與心肌纖維化的關系需要更深入的研究。

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Objective To investigate the expression of microRNA-214 in the myocardial fibrosis induced by pressure-overloaded treatment and the effect of enalapril in this process. Methods 80 male Spargue Dawley rats randomly was divided two groups: sham-operation group (n=40) and pressure-overloaded group (n=40) ,each group was divided two subgroups: enalapril treatment subgroup (n=20) and without enalapril treatment subgroup (n=20). Using ELISA kits to detect the level of PICP, ICTP, MMP-2 and TIMP-2 in serum, furthermore qrt-PCR was used to analyzed the expression of microRNA-214. Results Compared with the sham group pressure-overloaded treatment can increase the level of PICP, ICTP, PICP/ ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 significantly[(161.3±16.3) ng/L, (3.06±0.5), (51.1±7.3), (2638.2±289.6 )pg/mL, (4396±365.9)ng/mL, P<0.05], after enalapril treatment the level of PICP, ICTP, PICP/ICTP ratio, MMP-2 and TIMP-2 were decreased[(2.5±0.7)ng/L, (45.1±16.3), (806.8±301.6) pg/mL, (2052.6±322.3),P<0.05]. MPP-2/ TIMP-2 ratio was (0.6±0.4) that is the lowest in pressure-overloaded group , After enalapril treatmen, MPP-2/ TIMP-2 ratio was elevated to (0.88±0.3). Meanwhile pressure-overloaded treatment can induce microRNA-214 overexpression[(2.1±0.3) fold relative to Sham group] and enalapril can decreased the expression of microRNA-214[(1.5±0.2) fold relative to Sham group]. Conclusion Enalapril can relieve the myocardial fibrosis caused by pressure-overloaded treatment and microRNA-214, which may be a target or indicator for therapy of myocardial fibrosis, was involved in this process.

Pressure overload; Rat; Enalapril; Myocardial fibrosis; microRNA-214

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.003

甘肅 730000 蘭州大學第一醫院 （王東 王芳） 蘭州石化總醫院 （魏文平）

王芳 E-mail:wangf_lzu@163.com