阿爾茨海默病患者外周血炎癥因子水平與認知功能的相關性研究

梁春榮，劉雨輝，王葉冉，曾凡，王鑫，曹紅元，易旭，胥娟，姚秀卿，高長越，張莉莉，許志強，王琳，周華東，王延江

阿爾茨海默病患者外周血炎癥因子水平與認知功能的相關性研究

梁春榮，劉雨輝，王葉冉，曾凡，王鑫，曹紅元，易旭，胥娟，姚秀卿，高長越，張莉莉，許志強，王琳，周華東，王延江

目的探討阿爾茨海默病(AD)患者血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平及其與認知功能的相關性。方法納入AD患者110例，以及年齡、性別匹配的認知功能正常的對照人群120例。搜集受試者的一般資料和疾病信息。采用簡易精神狀態量表(MMSE)和臨床癡呆評定量表(CDR)對受試者認知功能和日常行為能力進行評估。收集血清，采用ELISA法測定血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的濃度。比較兩組血清炎癥因子水平的差異，采用非條件logistic回歸篩選AD可能的影響因素。以全部人群為研究對象，分析血清炎癥因子水平與MMSE評分的相關性。以AD組為研究對象，分析患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關性。結果AD組血清中IL-1β(秩均值129.46pg/m l vs 102.70pg/m l，P=0.002)、IL-6(秩均值125.25pg/m l vs 106.56pg/m l，P=0.033)水平顯著高于對照組，但TNF-α(秩均值116.40pg/m l vs 114.67pg/m l，P=0.844)和IFN-γ(秩均值115.90pg/m l vs 115.14pg/m l，P=0.931)水平與對照組相比差異無統計學意義。整體人群中，僅IL-1β水平與MMSE評分呈負相關(r=－0.184，P＝0.007)。AD患者血清中各炎癥因子水平與CDR評分無相關性。危險因素分析顯示，IL-1β是罹患AD的危險因素(OR=1.018，95%CI 1.005～1.030 )，受教育年限為保護性因素(OR=0.891，95%CI 0.834～0.953)。結論血清炎癥因子水平與整體人群的認知功能相關，但與AD患者的癡呆嚴重度無明顯相關性。

阿爾茨海默病；白細胞介素類；認知障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進行性的認知功能下降、記憶缺失、運動功能障礙為主要臨床表現的神經退行性疾病，以腦內Aβ沉積及神經纖維纏結為主要病理改變。研究認為，AD的神經退行性變與炎癥反應相關[1]。AD患者腦內Aβ斑塊及神經纖維纏結周圍可以發現大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥介質，而在年齡匹配的正常人中并未發現炎癥因子[2]。腦內長期炎癥反應可產生神經毒性作用并進一步刺激Aβ的產生[3]。近年來的研究還發現，炎性系統疾病也可促進AD的發生發展[4]。過去對于AD患者外周血炎癥因子水平的研究較少，且結果并不一致。本研究旨在比較AD患者與正常對照人群外周血中炎癥因子水平的差異，并探討外周血炎癥因子水平與病情的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年1月－2013年9月第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所神經內科門診及住院的AD患者110例，病例資料完整。采用頻數匹配的方法從同一時期本院體檢中心選擇性別、文化程度與AD患者匹配且認知功能正常的健康體檢人員120例。

1.2 診斷標準 癡呆的診斷采用美國精神病學會的精神障礙診斷和統計手冊(DSM-Ⅳ)標準，AD的診斷采用美國神經病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)標準。健康對照組采用簡易精神狀態量表(m ini-mental state exam ination，MMSE)進行評分，確定其認知功能正常，判定標準：受試者所測評分大于相應文化程度的最高值(文盲＞17分，小學＞20分，中學以上＞24分)。

排除標準：可能影響認知功能的疾病(如嚴重的帕金森病)；自身免疫疾病；近期有感染史；嚴重的心、肺、肝、腎疾病及腫瘤。

1.3 研究指標

1.3.1 一般資料 AD患者均具備顱腦CT或MRI影像學資料。記錄患者的高血壓病、糖尿病、高低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)血癥、冠心病、自身免疫性疾病等病史信息。

1.3.2 認知功能和日常行為能力評定 所有研究對象均有完整的MMSE和臨床癡呆評定量表(clinical dementia rating，CDR)資料，以評估其認知功能和日常行為能力。

1.3.3 血清炎癥因子測定 采集受試者靜脈血5m l，4℃下800g離心10m in，取血清，分裝于600μl EP管中(200μl/管)，置于–80℃超低溫冰箱保存備用。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ，試劑盒均購于北京四正柏生物科技有限公司，按照說明書進行操作。采用酶標儀(BioTek公司，美國)于450nm波長下讀取吸光度值，依據標準曲線獲取相應炎癥因子濃度，單位均為pg/m l。

1.3.4 ApoE基因型測定 對所有血液標本采用鏈式聚合酶反應-限制性片段長度多態性 (PCR-RFLP)方法進行ApoE基因型檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。血清炎癥因子水平的分布圖采用Prism軟件進行繪制。對兩組樣本不同炎癥因子濃度進行正態性檢驗，在數據不滿足正態性分布的情況下采用非參數Wilcoxon秩和檢驗比較兩組炎癥因子水平總體分布位置是否相同；炎癥因子與MMSE和CDR的相關性采用偏相關分析法。采用非條件logistic回歸進行AD影響因素的分析，采用向前逐步回歸法篩選變量，選入變量的檢驗水準為0.05，剔除變量的檢驗水準為0.10。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基線資料 AD組患者110例，其中男54例，女56例，年齡49～91(71.5±10.6)歲；對照組120例，其中男59例，女61例，年齡42～93(69.5±9.3)歲。兩組間年齡和性別差異無統計學意義。AD組CDR評分和糖尿病患病率顯著高于對照組(P＜0.05)，MMSE評分和教育水平顯著低于對照組(P＜0.05)。兩組間ApoE ε4基因擴增水平、高血壓病和高膽固醇血癥的發生比例差異無統計學意義(表1)。

2.2 兩組血清炎癥因子水平比較 對兩組炎癥因子水平的秩均值進行比較，結果顯示，AD組血清中IL-1β(129.46pg/m l vs 102.70pg/m l，P=0.002)、IL-6(125.25pg/m l vs 106.56pg/m l，P=0.033)水平顯著高于對照組，但TNF-α(116.40pg/m l vs 114.67pg/m l，P=0.844)和IFN-γ(115.90pg/m l vs 115.14pg/m l，P=0.931)水平與對照組相比差異無統計學意義(圖1)。

表1 研究對象的基線資料特征Tab.1 Baseline data of study subjects

2.3 血清炎癥因子水平與MMSE評分的相關性分析 采用偏相關分析法，校正了年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型，分析全部人群血清中炎癥因子水平與MMSE評分的相關性。結果如表2所示，IL-1β水平與MMSE呈負相關(r=–0.184，P＝0.007)，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平與MMSE無相關性。

圖1 兩組血清炎癥因子水平的比較Fig.1 Comparison of serum inflammatory cytokine levels between AD patients and healthy controls

表2 血清炎癥因子水平與MMSE的相關性(n=230)Tab.2 Correlation between serum inflammatory cytokine levels and MMSE scores (n=230)

2.4 AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關性分析 采用偏相關分析法，校正了年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型，分析AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關性。結果如表3所示，AD患者血清中炎癥因子水平與CDR無相關性，表明AD患者血清中的炎癥因子水平與AD的嚴重程度無關。

2.5 AD影響因素的多因素分析 對AD患者血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型進行非條件logistic回歸分析，結果發現IL-1β、IFN-γ的偏回歸系數(β)為正值且OR值大于1，說明血清中IL-1β水平越高，罹患AD的風險越高，受教育年限偏回歸系數為負值且OR值小于1，說明受教育程度越高患AD的風險越低(表4)。

表3 AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關性(n=110)Tab.3 Correlation between serum inflammatory cytokine levels and CDR scores in AD patients (n=110)

表4 AD影響因素的非條件logistic回歸Tab.4 Multivariate logistic analysis of risk factors for AD

3 討 論

既往已有關于AD患者血清炎癥因子水平的研究，但結論并不一致：有研究認為在AD患者中血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著增高，IFN-γ水平低于對照組，在輕度認知功能損害(MCI)患者IFN-γ、TNF-α水平顯著增高，而IL-6水平則無明顯變化[5-7]；另外有研究發現在AD和MCI患者血清中TNF-α水平低于對照組[8]；也有研究發現在AD和MCI患者腦脊液中TNF-α水平高于健康對照組[9]，而血清中TNF-α水平無明顯差異。不過，既往這些有關AD患者血清炎癥因子水平的研究樣本量均較小，入組人數從十余人到數十人不等。

為了更好地反映AD患者血清炎癥因子水平的變化，本研究選擇了110例患者進行了分析，結果表明，AD患者血清IL-6和IL-1β水平均增高。這一發現與AD腦內神經炎癥的病理變化一致。既往對AD患者尸檢并采用免疫組化染色發現大腦皮質斑塊周圍有大量的IL-6、IL-1β表達[10]。

關于血清中炎癥因子的來源目前尚不清楚，可能來自于外周組織、血液白細胞及血管壁的內皮細胞，也可能來源于大腦炎癥反應。研究表明，腦內的炎癥反應可促進外周血細胞炎癥因子的釋放，而外周血中的炎癥因子也可改變血-腦脊液屏障的通透性，促進炎癥因子及白細胞進入腦內[11-12]。在AD患者腦內，Aβ可刺激小膠質細胞的吞噬作用，并誘導TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放[13-14]，炎癥因子又可誘導神經元β-淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)合成增加[15]和Aβ產生[16]，Aβ與炎癥因子在腦內形成惡性循環，相互促進，促使Aβ生成增多和神經元變性死亡。

目前眾多觀點支持炎癥反應參與了AD的發生，認為在AD癥狀出現之前腦內已存在炎癥反應，腦內的炎癥因子會通過血-腦脊液屏障進入血液，并可在后續促使外周血細胞釋放炎癥因子[17-18]。因此，有學者提出檢測外周血中的炎癥因子水平并將其作為診斷AD的生物標志物[19]。但是，目前尚缺乏血液炎癥因子與認知功能和癡呆嚴重程度相關性的研究。本研究結果表明，血清IL-1β水平與整體人群的MMSE呈負相關，但IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子水平卻與AD患者的癡呆嚴重程度無相關性，且這些炎癥因子也不是AD的特異性分子，該結果提示炎癥反應參與了AD的發生，但將炎癥因子作為AD診斷的生物標志物并不合適。

后續我們將進一步在MCI階段即AD發生前期的人群中探尋特異性、高表達的炎癥因子并通過較大樣本、前瞻、對照設計的臨床研究探討炎癥因子在AD發生、發展中的作用。

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Correlation between serum inflammatory factor levels and cognitive function in patients withAlzheimer's disease

LIANG Chun-rong, LIU Yu-hui, WANG Ye-ran, ZENG Fan, WANG Xin, CAO Hong-yuan, YI Xu, XU Juan, YAO Xiuqing, GAO Chang-yue, ZHANG Li-li, XU Zhi-qiang, WANG Lin, ZHOU Hua-dong, WANG Yan-jiang*
Department of Neurology, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
*

, E-mail: yanjiang_wang@tmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the serum levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and IFN-γ, and explore the correlation between the inflammatory factor levels and the cognitive function in patients w ith Alzheimer's disease (AD).MethodsOne hundred and ten AD patients and 120 cognitively normal subjects were recruited in the present study.Serum levels of IL-6, IL-1β, TNF-α and IFN-γ were determ ined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).M ini-Mental State Examination (MMSE) and Clinical Dementia Rating Scale (CDR) were used to assess the cognitive function and activities of day living of the subjects.Wilcoxon rank sum test was used to compare the inflammatory cytokine levels between AD patients and healthy controls.Non-conditional logistic regression model was used to screen the potential influence factors of AD.Partial correlation analysis was performed to study the correlation between inflammatory cytokine levels of all subjects and MMSE scores in the whole sample, and the correlation between the serum levels of inflammatory cytokines and CDR scores was exam ined in the ADcohort.ResultsThe serum levels of IL-1β (129.46 vs 102.70, P=0.002) and IL-6 (125.25 vs 106.56, P=0.033) were significantly higher in AD patients than that of normal control, while the values of TNF-α (116.40 vs 114.67, P=0.844) and IFN-γ (115.90 vs 115.14, P=0.931) were not significantly different between the two groups.The serum levels of IL-1β was correlated with MMSE score (r=–0.184, P=0.007) in the whole sample.No significant correlation was observed between serum inflammatory factors and CDR scores in AD patients.IL-1β was identified as a risk factor (OR=1.018, 95%CI 1.005-1.030), and duration of receiving education as a protective factor (OR=0.891, 95%CI 0.834-0.953) for AD.ConclusionThe serum levels of inflammatory factors may be correlated with the cognitive function but not with the severity of dementia in AD patients.

Alzheimer disease; interleukins; cognition disorders

749.16

0577-7402(2014)02-0133-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.11

2013-12-17；

2014-01-13)

(責任編輯：沈寧)

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30973144, 81270423), Science Fund of Chongqing Municipality for Distinguished Young Scholars (CSTC 2010BA5004), China Postdoctoral Science Foundation (2013T60955), and Scientific Projects of Chongqing Municipality for Postdoctoral Research (Xm201342)

國家自然科學基金(30973144、81270423)；重慶市杰出青年科學基金(CSTC 2010BA5004)；中國博士后科學基金(2013T60955)；重慶市博士后科研項目(Xm201342)

梁春榮，碩士研究生。主要從事老年癡呆發病機制方面的研究

400042 重慶 第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所神經內科(梁春榮、劉雨輝、王葉冉、曾凡、王鑫、曹紅元、易旭、胥娟、姚秀卿、高長越、張莉莉、許志強、王琳、周華東、王延江)

王延江，E-mail: yanjiang_wang@tmmu.edu.cn