力竭運動對大鼠腎小管凋亡和缺氧誘導因子-1α表達的影響及人參總皂苷干預研究

王會玲，李燕，田軍，胡偉鋒，張金元

高強度軍事訓練或過度運動可能導致急性腎損傷(exercise-induced acute kidney injury，EIAKI)[1]。EIAKI指因劇烈運動或體能訓練后，短時間內引起的非創傷性血尿、蛋白尿或腎功能異常[2]。軍隊新兵入伍訓練、大學入學新生體能訓練或運動員馬拉松長跑等，均容易出現EIAKI。EIAKI是軍事醫學、運動醫學和臨床醫學面臨的亟待解決的問題之一。EIAKI發生機制尚待闡明，目前認為主要與短時間劇烈運動使機體血流動力學發生改變，腎血流灌注相對不足，同時腎組織局部神經內分泌發生急劇變化，從而造成急性腎小管壞死有關[3]。我們既往研究發現，過度運動可引起大鼠急性腎小管損傷，使腎臟局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)升高及氧自由基生成增多，氧化應激反應在腎小管損傷中發揮重要作用；人參總皂苷具有一定的抗氧化應激、改善腎損害的作用[4]。近年來研究發現缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)對腎缺血損傷具有重要作用。HIF-1α在EIAKI病理生理過程中發揮何種作用，人參總皂苷是否通過HIF-1α影響腎小管損傷修復，值得進一步研究。因此，本研究探討人參總皂苷對力竭運動大鼠腎臟腎小管上皮細胞(tubular epithelial cells，TEC)凋亡以及腎組織HIF-1α表達的影響，以期為人參總皂苷防治EIAKI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 雄性SD大鼠35只，體重350±10g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[合格證號：SCXF(滬)2010-0005]，SPF級。人參總皂甙(南京替斯艾么中藥研究所)。考馬斯亮藍(美國Bio-Rad公司)；細胞凋亡試劑盒(美國Chemicon ApopTag S7100)；抗體Cleaved-Caspases-3(美國Santa Cruz公司)，HIF-1α(美國Cell signaling公司)，熒光二抗(Alexa Fluor 680/800，Invitrogen公司)，Cell Lytic MT組織裂解液(Sigma公司)，Odyssey遠紅外激光掃描儀(LiCor公司)。

1.2 實驗動物分組 35只大鼠在本實驗室適應性飼養2d后，隨機分為5組：安靜對照組(CTL，n=7)、模型組[再分為2h組(M2，n=7)及24h組(M24，n=7)]、人參總皂苷干預組[再分為2h組(G2，n=7)及24h組(G24，n=7)]。G2和G24組于運動前5d給予人參總皂苷100mg/(kg·d)灌胃，1次/d；M2、M24和CTL組給予等體積蒸餾水灌胃，共5d。

1.3 造模方法及標本收集 跑臺運動：大鼠首先以10～15m/min速度進行適應性跑臺運動15min，跑臺坡度0°；然后使其在30°坡度以25m/min速度持續運動45min或力竭。力竭標準：大鼠不能堅持本負荷跑速，先后滯留跑道3次以上，行為表現為俯臥位、垂頭、呼吸幅度大，對刺激無反應。力竭游泳方法：動物休息10min后，置于水深55cm、水溫30±2℃的泳池中進行力竭游泳，以大鼠3次沉沒于水中超過10s，且放在平面上無法完成翻正反射為力竭，然后將大鼠用電吹風機吹干入籠。CTL組動物在相同條件下常規飼養，不參與跑臺及游泳運動。記錄各組力竭運動后滯留跑道動物數目以及力竭游泳時間。運動后2、24h后分別處死7只大鼠并采集標本：10%水合氯醛麻醉，斷頭采血，打開腹腔，暴露腎臟，經0.9%氯化鈉溶液灌注，留取雙腎，左腎切片2mm厚，置于10%甲醛固定，右腎置于–80℃保存待測。

1.4 腎組織病理學觀察 腎組織經脫水、石蠟包埋，切片3μm，常規HE染色，光鏡下觀察并攝片。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 腎臟組織標本石蠟包埋，切片厚4μm，常規脫蠟至水，2%過氧化氫于室溫反應5min，加入過氧化物酶(TdT酶)緩沖液，室溫1～5min，加TdT酶反應液，置濕盒中于37℃反應1h，加脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]30min，洗滌，DAB顯色，甲基綠復染，二甲苯脫水、干燥、封固。光鏡下觀察細胞核顯示為棕黃色顆粒為陽性凋亡細胞。每張切片隨機選取10個以上腎皮髓質交界處高倍視野，計數陽性細胞核數目，并取平均數進行分析。

1.6 免疫組化檢測Caspases-3、HIF-1α的表達 石蠟切片4μm厚，常規脫蠟至水，采用ABC法操作常規進行，以PBS代替一抗為陰性對照，陽性呈深棕色。一抗工作濃度：Caspase-3為1:50，HIF-1α為1:100。采用朗珈軟件分析系統，高倍下測量免疫組化陽性區域面積(Area)和光密度(A)值，計算免疫組化指數(IHCP=Area×A)。

1.7 Western blotting檢測Caspases-3、HIF-1α的表達 提取總蛋白，考馬斯亮藍檢測蛋白濃度，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，加入Caspases-3、HIF-1α一抗，4℃過夜；洗膜，加入熒光二抗，孵育30min；洗膜后，Odyssey激光成像掃描。Caspases-3、HIF-1α的蛋白表達量用內參照GAPDH進行校正。

1.8 統計學處理 采用SPSS 14.0軟件進行分析，計量數據以s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況及力竭游泳時間 大鼠運動前精神飽滿、目光有神、對刺激反應靈敏；運動早中期，大鼠可跟上跑臺運動速度和坡度的變化，運動后期因疲勞而滯留跑道；力竭游泳后，大鼠全身癱軟、目光黯淡無神、對周圍刺激反應淡漠。與CTL組比較，模型組(n=14)大鼠跑臺運動時，11只出現力竭滯留跑道，力竭游泳時間明顯縮短(11.32±3.63min)；與模型組比較，人參總皂苷組(n=14)大鼠耐力明顯增強，僅6只出現力竭，力竭游泳時間顯著延長(19.59±8.26min)，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 TEC細胞凋亡 石蠟切片上凋亡細胞核質呈棕黃色熒光染色陽性，或染色不均呈半月形，或形成凋亡小體，濃縮的核質緊貼于核膜。CTL組腎組織僅見少許陽性細胞。模型組在過度運動后2h凋亡數目即增加，M2組可見較多陽性細胞，主要分布于皮髓質交界處的TEC，髓質腎小管和集合管也可見陽性著色；M24組的陽性細胞數目明顯增加。G2、G24組的凋亡陽性細胞數目較M2、M24組明顯減少(圖1)。

圖1 TUNEL法檢測大鼠TEC細胞凋亡(×40)Fig.1 Apoptosis of tubular epithelial cells detected by TUNEL(×40)

2.3 Caspases-3及HIF-1α在腎組織的分布及表達免疫組化檢測顯示，Caspases-3陽性呈棕黃色顆粒散在分布于細胞質內，在損傷壞死較明顯的部位，可呈深棕色濃染。Caspases-3陽性表達以皮髓質交界處TEC最為明顯，髓質的腎小管和集合管可見散在分布，與凋亡細胞分布一致，腎小球幾乎無表達。CTL組僅見個別腎小管弱陽性淡染；模型M2組的表達較CTL組增強，M24組的表達明顯升高，在刷狀緣脫落的腎小管處呈顆粒樣強陽性著色。與模型組比較，人參總皂苷干預后G2、G24組的Caspases-3陽性表達均較M2、M24組明顯下降。HIF-1α陽性也主要表達于皮髓質交界處TEC，CTL組腎組織幾乎未見HIF-1α陽性表達，模型M2、M24組的表達較CTL組明顯增強，在損傷腎小管周圍的微小血管可呈強陽性表達。與模型組比較，人參總皂苷干預G2、G24組的HIF-1α陽性表達水平較M2、M24組更顯著，在損傷小管陽性表達明顯，少許腎小球也有表達，G24組的表達也維持在較高水平(圖2)。

2.4 腎組織Caspases-3、HIF-1α蛋白的表達水平Western blotting檢測結果顯示，CTL組僅有微量Caspases-3和HIF-1α蛋白表達，模型組Caspases-3顯著上調，M2組上調約2.7倍、M24組上調約3.0倍；而人參皂苷干預組的Caspases-3表達水平較CTL組明顯升高，但與模型組比較則呈一定程度下調，G2、G24組分別較M2、M24組下調約58%、61%(圖3A)。M2組HIF-1α表達水平上調約2.8倍，M24組上調約2.2倍(P＜0.01)；人參總皂苷G2組的HIF-1α表達與CTL組比較上調4.6倍，與M2組比較上調約1.6倍；G24組的HIF-1α表達較CTL組上調3.7倍，較M24組上調約1.5倍，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01，圖3B)。

圖2 免疫組化檢測大鼠腎組織Caspases-3及HIF-1α表達(×40)Fig.2 The expression of caspases-3 and HIF-1α in rat' kidney detected by immunohistochemistry(×40)

圖3 腎組織Caspases-3(A)及HIF-1α(B)蛋白表達水平(Western blotting)Fig.3 Protein expression of caspases-3 (A) and HIF-1α (B) in rat' kidney detected by Western blotting

3 討 論

運動與腎臟損傷的關系尚待明確。一般認為低強度耐力訓練對機體的應激性刺激較小，而高強度過度運動可損傷機體，產生疲勞甚至過度疲勞，成為不良刺激因素而產生損害。研究發現運動可引起健康人群尿蛋白排泄明顯增加，馬拉松運動后1h尿白蛋白排泄率從15μg/min上升至316μg/min；腎血流量可下降31%，腎小球濾過率也有輕微降低，尿中腎損害標志物中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)升高7.7倍[5]。輕中度運動量引起腎小球性蛋白尿(尿白蛋白)增加，而高強度運動可使腎小管性蛋白尿(β2微球蛋白)排泄增加[6]。EIAKI的腎損傷機制不明，目前認為氧化應激損傷可能是過度運動致腎損傷的主要機制。短時間高強度超負荷的運動，影響機體血流動力學，使腎臟組織供血急劇減少，形成運動性腎缺血，而運動后隨著腎臟血供恢復，可形成缺血性再灌注，導致腎臟局部氧化應激反應加劇，氧自由基活性增強，從而造成對腎細胞的實質性損害，主要表現為皮髓交界部的腎小管發生細胞凋亡[7]。

細胞凋亡是早期腎損傷細胞死亡的主要形式，在多種腎病模型中均觀察到腎組織細胞凋亡現象，Caspase-3作為關鍵執行分子，是細胞凋亡性死亡的最終執行者[8-9]。文獻報道高強度運動可使腎臟局部脂質過氧化反應增強，對細胞生物膜產生毒害作用，同時引起皮髓質血管緊張素Ⅱ水平升高，誘導腎組織凋亡[8,10]；大鼠游泳至力竭可導致明顯的腎組織細胞凋亡，力竭后24h在腎組織皮髓質交界處及髓質腎小管和集合管，可見大量散在成片狀分布的凋亡細胞，并可能通過破壞TEC的Bax/Bcl-2信號平衡，激活Caspases-3依賴的凋亡信號通路，進而誘導TEC凋亡[11-12]。

人參總皂苷是中藥人參的提取物，具有提高機體免疫力、抗衰老、減輕組織器官的缺血再灌注損傷，減輕細胞內鈣超負荷、抗細胞凋亡等作用[13]。研究提示，人參總皂苷可減輕細胞線粒體的損傷、改善缺氧組織的能量代謝，保護缺血損害時細胞膜及其亞細胞結構，對缺血性腎衰竭腎臟具有明顯的保護作用[14-15]。我們通過跑臺運動及力竭游泳方法制作大鼠EIAKI模型，應用TUNEL法檢測腎固有細胞凋亡情況，發現模型組在過度運動后2h皮髓質交界處TEC凋亡數目即增加，24h后凋亡細胞明顯增加；而人參總皂苷干預治療后，上述陽性細胞數目明顯下降，證明人參總皂苷可改善細胞EIAKI引起的TEC凋亡，結果提示過度運動加力竭游泳可引起腎小管上皮損傷，導致細胞凋亡，人參總皂苷可改善細胞凋亡。對腎組織免疫組化分析顯示，過度運動后造成腎小管局部損傷，凋亡關鍵信號蛋白Caspases-3表達增強，24h時在刷狀緣脫落的小管處呈顆粒樣強陽性著色；而人參總皂苷干預G2、G24組的Caspases-3陽性表達均較M2、M24組明顯下降。Western blotting檢測結果也顯示，模型組Caspases-3蛋白表達水平在2、24h逐漸上調，提示人參總皂苷可通過下調Caspases-3依賴的凋亡信號，抑制TEC凋亡，從而保護過度運動后的腎損傷。

HIF-1α是介導缺氧適應性反應的細胞轉錄因子，廣泛參與氧敏感特異性調控應答，在低氧時迅速啟動基因激活，并通過核移位和轉錄活化、蛋白表達的調節等發揮作用，使機體對缺血缺氧產生適應性反應，是缺氧誘導基因調控和修復細胞內氧環境穩定的核心調節因子[16-17]。HIF-1α高表達于TEC，其對急性腎損傷的保護作用近年來受到重視。Rosenberger等[18]對大鼠AKI模型的研究發現，HIF-1α早期快速激活對腎臟在缺氧損傷中的反應性保護具有重要作用。本研究發現HIF-1α表達水平在模型組M2上調約2.8倍，在M24上調約2.2倍，這可能是機體對缺血缺氧的一種保護性反應。人參總皂苷干預組HIF-1α在早期即快速上調，并持續高水平表達，提示人參總皂苷通過上調HIF-1α表達水平，減輕了腎組織的缺血缺氧損害，這可能是人參總皂苷改善腎損傷的重要機制之一，其影響環節有待進一步研究。

綜上所述，過度運動可導致大鼠TEC凋亡，Caspases-3表達水平上調；人參總皂苷可通過下調Caspases-3依賴的凋亡信號，快速上調HIF-1α表達水平，減輕TEC凋亡，從而保護過度運動后的腎損傷，這可能是人參總皂苷改善過度運動性腎損傷的重要機制之一。

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