Rab25蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

周璞，刁鑫偉，湯金梁，彭麗娜，張洪川，陳正堂

肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率均居首位的惡性腫瘤[1]，雖然綜合治療水平不斷提高，但患者5年生存率并無明顯改善[2-3]。對肺癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究可幫助我們尋找更好的治療切入點。Rab25屬于Rab蛋白家族，在調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖分化、囊泡運輸、細胞骨架形成、胞吞作用等方面均發(fā)揮重要作用，特別是在調(diào)控細胞內(nèi)囊泡運輸方面起著關(guān)鍵的分子開關(guān)作用[4]。多項研究證實Rab25與腫瘤關(guān)系非常密切，它既是促癌因子又是抑癌因子[5-6]。本研究小組前期工作發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌干細胞表達上調(diào)的原癌基因中，Rab25上調(diào)倍數(shù)最大。本研究通過免疫組化法檢測Rab25蛋白在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達，并分析其與NSCLC臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，為進一步研究Rab25在NSCLC中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集2009年1月－2010年6月第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的NSCLC石蠟組織標(biāo)本61例，癌旁組織40例。所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未接受過放化療、生物治療及其他治療。術(shù)后立即切取標(biāo)本，其中男45例，女16例，年齡56.2±9.1(33～72)歲，中位年齡58歲；鱗癌31例，腺癌26例，腺鱗癌4例；TNM分期Ⅰ期30例，Ⅱ－Ⅲ期31例。本研究通過第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Rab25鼠單克隆抗體購自Abcam公司，山羊抗鼠二抗及免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測Rab25蛋白表達 采用兩步法(MaxVisionTM)，步驟如下：所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，2μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過氧化氫封閉13min后置于檸檬酸緩沖液進行高壓修復(fù)，冷卻；滴加Rab25鼠單克隆抗體(1:500)，4℃孵育過夜；次日取出，37℃復(fù)溫；加入過氧化物結(jié)合的山羊抗鼠二抗，室溫孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下檢測并拍照。染色結(jié)果根據(jù)陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數(shù)進行分級，每張切片隨機觀察5個高倍視野(×400)，每個視野觀察100個細胞，陽性細胞百分數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；細胞染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色及深黃色為2分，褐色及深褐色為3分。陽性強度為兩種積分乘積：0分為陰性(－)，1～4分為弱陽性()，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性。最后積分＜6分定義為低表達，≥6分為高表達。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師按照雙盲、獨立的原則進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，以行×列表資料χ2檢驗及校正χ2檢驗、秩和檢驗分析NSCLC與癌旁組織Rab25的表達差異，及Rab25表達與臨床病理因素(性別、年齡，腫瘤大小、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Rab25蛋白的表達 免疫組化結(jié)果顯示，在NSCLC的細胞膜和細胞質(zhì)中均有Rab25表達，但細胞核中無表達(圖1)。61例NSCLC組織中Rab25的陽性表達率為93.4%(57/61)，40例癌旁組織中Rab25的陽性表達率為27.5%(11/40)，兩者表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2 Rab25蛋白表達與臨床病理因素的關(guān)系Rab25蛋白在患者性別、年齡、有無吸煙、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。腫瘤體積≥4cm患者的Rab25蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤體積＜4cm的患者(48.5%vs 21.4%，P=0.028)。Ⅱ－Ⅲ期患者Rab25蛋白陽性表達率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%，P=0.042，表2)。

圖1 NSCLC組織與癌旁組織中Rab25蛋白的表達(免疫組化)Fig. 1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal tissues(Immunohistochemical staining)

表1 Rab25蛋白在NSCLC和癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal lung tissue

表2 Rab25蛋白表達與NSCLC患者臨床病理因素相關(guān)性(n=61)Tab.2 Correlation of the expression of Rab25 protein and clinicopathological factors of NSCLC patients(n=61)

3 討 論

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多個促癌基因激活和抑癌基因失活的過程，尋找腫瘤相關(guān)基因并研究其作用機制，可更好地闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，為治療腫瘤探尋新的道路。基因Rab25位于人染色體1q22，橫跨9kb，僅在胃腸黏膜、肺、腎等上皮組織中表達。Rab25蛋白為小GTP結(jié)合蛋白，在細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運中起分子開關(guān)的作用，并與GTP的結(jié)合和水解相偶聯(lián)[7]。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，Rab25在肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺侵襲癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達，在腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[8-11]。但是，在激素不敏感型乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中，Rab25卻扮演抑癌因子的角色，確切機制尚不明確[12-13]。本課題組前期研究采用基因芯片技術(shù)篩選人正常肺干細胞和肺腺癌干細胞差異表達的基因，結(jié)果顯示在表達上調(diào)的11個原癌基因中Rab25上調(diào)最高，為18.1倍[14]。因此，推測Rab25可能在NSCLC中亦發(fā)揮重要作用，但目前國內(nèi)外鮮有相關(guān)研究報道。

本研究結(jié)果顯示，Rab25在NSCLC組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織(93.4% vs 27.5%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，可見在NSCLC中Rab25存在異常高表達，與我們前期研究結(jié)果較為一致。而且，NSCLC腫瘤體積≥4cm患者的Rab25陽性表達率明顯高于體積＜4cm的NSCLC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)，推測在NSCLC中Rab25可促進腫瘤增殖，發(fā)揮促癌因子作用。已有多項體內(nèi)和體外實驗證實，在多種腫瘤細胞中上調(diào)Rab25表達，可使細胞群增殖和存活顯著提高，采用小干擾RNA下調(diào)Rab25表達，可使細胞凋亡增加，侵襲黏附能力下降[15-17]。Cheng等[18]最新研究發(fā)現(xiàn)，Rab25不僅能下調(diào)凋亡蛋白BAX和BAK，激活PI3K-Akt信號通路，促進癌細胞增殖和減少凋亡，還能增加癌細胞內(nèi)糖原儲備，在營養(yǎng)缺乏的情況下可減輕細胞生物能量學(xué)壓力。

此外，Rab25可通過控制囊泡運輸及與整合素α5β1相互作用，加速腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。在人卵巢腫瘤細胞A2780中，Rab25直接作用于遷移細胞偽足頂端整合素α5β1的β亞基，增強癌細胞穿透基質(zhì)的能力，促進細胞在含有纖維連接蛋白的3D基質(zhì)中的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。多項臨床試驗[5]也證實，Rab25高表達和乳腺癌、卵巢癌等患者的低生存率和不良預(yù)后密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，NSCLCⅡ－Ⅲ期患者Rab25陽性表達率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.042)，可見Rab25高表達促進了NSCLC的惡性生物學(xué)行為，并且可能成為判斷患者不良預(yù)后和生存期的指標(biāo)之一。本實驗對深入研究Rab25在NSCLC中的作用及機制，進一步發(fā)掘更多運輸?shù)鞍自谀[瘤中的重要功能奠定了基礎(chǔ)，為腫瘤治療提供了新的思路。

[1]Spiro SG, Tanner NT, Silvestri GA, et al. Lung cancer: progress in diagnosis, staging and therapy[J]. Respirology, 2010, 15 (1):44-50.

[2]Ge CL, Li XY, Shang K, et al. Risk factors for prediction of outcome of non-small lung cancer[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2011, 46(2): 216-219.[葛辰蕾, 李醒亞, 尚可, 等. 非小細胞肺癌預(yù)后影響因素分析[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011, 46(2): 216-219.]

[3]Cui Y, Qi DL. Now and future: Erlotinib for treatment-resistant lung cancer[J]. Tianjin Med J, 2012, 40(10): 93-96.[崔焱，齊大亮. 厄洛替尼 耐藥型肺癌治療的現(xiàn)狀與展望[J]. 天津醫(yī)藥, 2012, 40(10): 93-96.]

[4]Mitra S, Cheng KW, Mills GB. Rab GTPases implicated in inherited and acquired disorders[J]. Semin Cell Dev Biol, 2011,22 (1): 57-68.

[5]Agarwal R, Jurisica I, Mills GB, et al. The emerging role of the RAB25 small GTPase in cancer[J]. Traffic, 2009, 10 (11): 1561-1568.

[6]Hutagalung AH, Novick PJ. Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology[J]. Physiol Rev, 2011 (91): 119-149.

[7]Agola J, Jim P, Ward H, et al. Rab GTPases as regulators of endocytosis, targets of disease and therapeutic opportunities[J].Clin Genet, 2011 (80): 305-318.

[8]Cao C, Lu C, Xu J, et al. Expression of Rab25 correlates with the invasion and metastasis of gastric cancer[J]. Chin J Cancer Res,2013, 25 (2): 192-199.

[9]Zhang JX, Wei J, Lu J, et al. Overexpression of Rab25 contributes to metastasis of bladder cancer through induction of epithelialmesenchymal transition and activation of Akt/GSK-3β/Snail signaling[J]. Carcinogenesis, 2013, 34 (10): 2401-2408.

[10]Yin YX, Shen F, Pei H, et al. Increased expression of Rab25 in breast cancer correlates with lymphatic metastasis[J]. Tumour Biol, 2012, 33(5): 1581-1587.

[11]Amornphimoltham P, Rechache K, Thompson J, et al. Rab25 regulates invasion and metastasis in head and neck cancer[J].Clin Cancer Res, 2013, 19(6): 1375-1388.

[12]Goldenring JR, Nam KT. Rab25 as a tumour suppressor in colon carcinogenesis[J]. Br J Cancer, 2011, 104 (1): 33-36.

[13]Cheng JM, Volk L, Janaki DK, et al. Tumor suppressor function of Rab25 in triple-negative breast cancer[J]. Int J Cancer, 2010,126 (12): 2799-2812.

[14]Luo FK, Zhao ZG, Zhao WP, et al. Analysis of the different gene expression profiles between lung adenocarcinoma stem cells and normal lung stem cells with cDNA microarrays[J]. Chin J Blood Transfusion, 2009, 22(4): 269-274. [羅福康, 趙正國, 陳正堂,等. 基因表達譜芯片分析人肺腺癌干細胞與肺正常干細胞的差異基因表達[J]. 中國輸血雜志, 2009, 22 (4): 269-274.]

[15]Fan Y, Xin XY, Chen BL, et al. Knockdown of Rab25 expression by RNAi inhibits growth of human epithelial ovarian cancer cells in vitro and in vivo[J]. Pathology, 2006, 38 (6): 561-567.

[16]Lapierre LA, Caldwell CM, Higginbotham JN, et al.Transformation of rat intestinal epithelial cells by overexpression of Rab25 is microtubule dependent[J]. Cytoskeleton, 2011,68(2): 97-111.

[17]Liu Y, Tao X, Jia L, et al. Knockdown of Rab25 promotes autophagy and inhibits cell growth in ovarian cancer cells[J].Mol Med Rep, 2012, 6 (5): 1006-1012.

[18]Cheng KW, Agarwal R, Mitra S, et al. Rab25 increases cellular ATP and glycogen stores protecting cancer cells from bioenergetic stress[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4 (2): 125-141.

[19]Kessler D, Gruen GC, Heider D, et al. The action of small GTPases Rab11 and Rab25 in vesicle trafficking during cell migration[J]. Cell Physiol Biochem, 2012, 29 (5-6): 647-656.

[20]Dozynkiewicz MA, Jamieson NB, Macpherson I, et al. Rab25 and CLIC3 collaborate to promote integrin recycling from late endosomes/lysosomes and drive cancer progression[J]. Dev Cell, 2012, 22 (1):131-145.