氮磷限制條件下螺旋魚腥藻產生土嗅素特征研究

賈曉燕,劉 聰,2,儲昭升*,龐 燕,胡小貞 (.中國環境科學研究院湖泊環境創新基地,環境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 0002；2.北京科技大學土木與環境工程學院,北京 00083)

隨著人類生活水平的不斷提高,對水質量的要求越來越高,水體異味已成為研究關注的重點.異味問題廣泛存在于各類淡水水體中,早在1883年就出現了有關水體異味的報道[1].已有研究表明了產生水體異味的主要原因[2]是水體富營養化,在富營養化水體中,由于營養物質過剩,藻類過度生長,由藻類代謝和腐爛分解產生的異味物質是水體中異味物質的主要來源.土霉味是淡水水體中存在最廣泛、且最難聞的異味.引起水體土霉味的主要物質之一是土嗅素[3-5].螺旋魚腥藻是一種常見的土嗅素產生藻.影響螺旋魚腥藻產生土嗅素的因素主要有溫度[6]、光照[7]和營養鹽[8-9].

目前國內關于水體異味及土霉味的研究主要集中在異味的分布及原因分析[10-12],異味物質的檢測技術[13-14]及水體異味的防治措施[15-16]等方面,開展室內模擬實驗,分析水體中氮磷含量對藻類生長及產生異味物質影響的研究鮮有報道.本文通過研究在氮限制和磷限制條件下,藻細胞密度、葉綠素 a的合成以及土嗅素產生量等,探討氮限制和磷限制對螺旋魚腥藻生長、土嗅素生成及釋放的影響,為更好的預測和控制魚腥藻水華暴發和預防由此產生的異味事件提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種及培養

本實驗所用螺旋魚腥藻從河北省秦皇島市洋河水庫分離獲得,在中國環境科學研究院藻類培養室進行培養.采用 M11培養基[17](mg/L:NaNO3100, K2HPO410, MgSO4·7H2O 75,CaCl2·2H2O 40, Na2CO320, Na2EDTA·2H2O 0.1),在溫度 26℃,光照強度 2500lx、光暗比 12h:12h的條件下培養.

1.2 培養實驗

本實驗在10L的玻璃瓶中分為2組進行,分別為缺氮條件和缺磷條件,每組設置兩個平行.在每個培養瓶中加入8L M11培養基和200mL的洋河水庫底泥濾液,其中氮限制控制氮的濃度為1/10M11培養基,則氮的濃度為 1.647mg/L(N:P=0.93);而磷限制則控制磷的濃度為 1/10M11培養基,則磷的濃度為 0.178mg/L(N:P=92.53),然后用高壓滅菌鍋在121℃下滅菌30min.

藻種在接種前分別在缺氮和缺磷的M11培養基中進行3d的饑餓培養.在無菌條件下接種至10L玻璃瓶中,接種量為 5×103cells/mL,培養時曝氣量為2.5L/min.藻細胞密度和葉綠素a每5d取樣進行分析,異形胞和土嗅素含量每3d取樣進行分析.

1.3 測定方法

藻細胞密度和異形胞用浮游植物計數板在光學顯微鏡下測定,每個樣品計數3次.土嗅素采取固相微萃取(美國 Supelco公司)與 HP7890/5975氣相色譜-質聯用儀(美國Agilent公司)進行測定[18].用玻璃纖維濾膜(Whatman GF-C)對藻液進行過濾后測定胞外土嗅素,用未過濾的藻液測定土嗅素總量.胞內土嗅素含量為土嗅素總量減去胞外土嗅素含量.葉綠素a采用玻璃研磨器,丙酮提取,分光光度法測定[19].總氮和溶解性總氮采用過硫酸鉀氧化,紫外分光光度法測定[20];總磷和溶解性總磷采用過硫酸鉀氧化,鉬銻抗分光光度法測定[21].

2 結果

2.1 螺旋魚腥藻的生長特征

螺旋魚腥藻在磷限制條件下的生長受到抑制,生長遲緩,而在氮限制條件下迅速進入一個相對較快的生長期(如圖 1所示).磷氮限制條件下最大藻細胞密度分別為 5.48×104,2.26×105cells/mL,后者是前者的4倍.

圖1 螺旋魚腥藻的生長曲線Fig.1 Growth curves of Anabaena sp.population

圖2 氮限制條件下異形胞形成的百分比Fig.2 Ratios of heterocyst under nitrogen-limited condition

螺旋魚腥藻在磷限制下幾乎不生成異形胞,在氮限制下則極易生成異形胞.在螺旋魚腥藻培養到第20d后異形胞形成比例為3.5%～4.4%(如圖2所示).

2.2 土嗅素生成量的變化趨勢

圖3 磷氮限制條件下土嗅素濃度的變化趨勢Fig.3 Varietion of geosmin concentration under phosphoruslimited condition and nitrogen-limited condition

圖4 單位細胞所含土嗅素濃度的變化Fig.4 Varietion of geosmin concentration in unit cell

在螺旋魚腥藻的整個生長過程中,其胞內土嗅素的含量都遠遠大于胞外(圖3).在磷限制條件下,土嗅素的最高濃度為 1.91×103ng/L;而在氮限制條件下,土嗅素的最高濃度為8.64× 103ng/L,遠遠高于前者.胞內土嗅素的濃度變化與藻細胞密度的變化趨勢基本一致.

在磷限制和氮限制2種培養條件下(圖4),單位細胞內土嗅素的濃度在培養的前 20d內都處于急速下降的趨勢,之后開始趨于平緩,分別維持在 3.18×10-5,3.68×10-5ng/cell左右.

2.3 葉綠素a的含量及與土嗅素含量的關系

螺旋魚腥藻單位細胞生成的葉綠素 a含量的變化趨勢(圖 5)表明,在磷限制條件下,每細胞所含葉綠素 a的濃度在培養的前 7d急速下降,之后基本維持在 1.89×10-3ng/cell;而在氮限制條件下,每細胞所含葉綠素 a濃度的下降趨勢并不明顯,維持在3.67×10-3ng/cell左右.在氮限制條件下,魚腥藻更易形成葉綠素 a,在磷限制條件下,魚腥藻形成葉綠素 a的過程受到抑制,其值遠低于氮限制條件下葉綠素a的量.

圖5 單位細胞所含葉綠素a濃度的變化趨勢Fig.5 Varietion of chl a concentration in unit cell

圖6 單位細胞分泌土嗅素與葉綠素質量比的變化趨勢Fig.6 Varietion of geosmin/Chl a ratio in unit cell

魚腥藻單位細胞產生的土嗅素與葉綠素 a的質量比(geosmin/chl a)在磷限制條件下要高于氮限制條件下(圖6).

2.4 培養過程中營養鹽的變化

在磷限制條件下,隨著藻細胞的生長,藻液中的溶解性總磷(DTP)逐漸降低(由 0.13mg/L降為0.02mg/L)(圖 7).在氮限制條件下,魚腥藻首先利用培養基中的氮源,藻液中的總氮(TN)和溶解性總氮(DTN)都有所下降(圖 7),當培養基中氮源不能滿足魚腥藻生長需要時,魚腥藻開始生成異形胞,并進行固氮作用.所以隨著藻細胞密度的增加,藻液中總氮(TN)的濃度有所提高.

圖7 磷限制下水體中磷的變化趨勢和氮限制下水體中氮的變化趨勢Fig.7 Varietion of phosphorus content in water column under phosphorus-limited condition and varietion of nitrogen content in water column under nitrogenlimited condition

3 討論

在磷限制和氮限制條件下,魚腥藻的生長情況不同.Rashash等[22]研究魚腥藻時,發現其藻細胞密度在低磷情況下比在低氮情況下明顯減少.這主要是由于螺旋魚腥藻為固氮藍藻,當其處在缺氮條件下時,魚腥藻會形成具有固氮作用的異形胞,異形胞可以直接固定大氣中的N2(分子態),形成藻細胞可以利用的氮素化合物,從而使其生長并不受到很大影響.在本研究中,在氮限制條件下,異形胞形成比率約為 3.8%,螺旋魚腥藻生長未受到明顯影響.在磷限制條件下,螺旋魚腥藻幾乎不生成異形胞且生長受到抑制;所以可以通過控制排入水體中磷的含量,使水體處于磷限制,更能有效避免魚腥藻過度生長.

在生成土嗅素方面,磷限制條件下單位細胞土嗅素的生成量比氮限制條件下的生成量低約15%.Wu等[23]研究魚腥藻發現魚腥藻中的異形胞比其他細胞產生更多的土嗅素,本研究中螺旋魚腥藻在氮限制條件下更易產生異形胞,推測由異形胞產生的土嗅素是螺旋魚腥藻單位細胞土嗅素的生成量在氮限制條件下高于磷限制條件下的主要原因.

不論是氮限制還是磷限制條件下,螺旋魚腥藻胞內土嗅素的含量都遠遠大于胞外土嗅素的含量,這說明螺旋魚腥藻在整個生長過程中,其生成的土嗅素大部分都保留在細胞內,只有很少一部分釋放到了水體.劉妍娟等[24]在研究螺旋魚腥藻土嗅素的產生和分布規律時報道螺旋魚腥藻的胞內土嗅素占總土嗅素的85%-95%,說明土嗅素在螺旋魚腥藻生長過程中主要分布在藻細胞內部;Jüttner等[25]研究表明在藻細胞內生長旺盛期(約前 4d),細胞內異味化合物濃度不斷增加,98%左右的異味化合物存在于細胞內,隨著細胞的衰老(第4d后),細胞內異味化合物濃度開始下降,而培養液中的異味化合物的濃度卻不斷增加;Rashash等[22]研究得出,在生長的初期,魚腥藻產生的土嗅素大部分保留在了細胞里,在 20d之后,細胞內和水體中的土嗅素比例相當;Rosen等[26]研究揭示魚腥藻細胞的死亡導致了細胞內土嗅素向介質中的釋放.本研究中在營養鹽限制條件下,螺旋魚腥藻的生長受到抑制,未達到衰敗期,故仍處于生成的土嗅素保留在細胞內的階段.基于上述情況,在預防水體中發生螺旋魚腥藻引起的嗅味問題時,可以通過過濾去除水體中的過量的藻類,從而減小發生水體的嗅味問題幾率.

4 結論

4.1 螺旋魚腥藻在磷限制下生長受到限制,幾乎不生成異形胞;在氮限制下生長未受到明顯影響,平均生成 3.8%異形胞.在磷限制條件下,螺旋魚腥藻產生土嗅素的最高濃度為 1.91×103ng/L;在氮限制條件下,土嗅素的最高濃度為 8.64×103ng/L.

4.2 不論是氮限制還是磷限制,螺旋魚腥藻在整個生長過程中,其生成的土嗅素大部分都保留在細胞內,只有很少部分(0.2%～10.4%)釋放到了水體.

4.3 魚腥藻單位細胞產生的土嗅素與葉綠素 a的質量比(geosmin/chl a)在磷限制條件下要高于氮限制條件下.

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