封閉群稀有鮈鯽對幾種常見化學品的敏感性

吳本麗,曹 巖,羅 思,王劍偉 (1.中國科學院水生生物研究所,湖北 武漢 430072；2.中國科學院大學,北京 100049；3.華中農業大學水產學院,湖北 武漢 430070)

國際上對化學品的生產、進口及使用等均已形成了相應的許可制度和法律法規.我國對有毒化學品的進出口也進行了嚴格控制,先后頒布了《新化學物質環境管理辦法》、《化學品測試導則》等法規和標準,要求新化學物質申報需“在中國境內用中國的供試生物完成的生態毒理學特性測試報告”.出于化學品環境管理和維護我國生態安全的需要,本土生物毒性測試技術體系成為亟待解決的問題.在我國化學品毒性測試推薦的試驗用魚中,稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是唯一的我國特有魚種,有關其毒性測試的國家標準正在研究中.

稀有鮈鯽是一種小型鯉科魚類,因具有生長周期短、產卵批次多等生物學特征使其成為一種理想的實驗魚材料[1],現已廣泛應用到胚胎學、遺傳學、毒理學等多個領域,尤其是在環境毒理學研究方面[3-8].過去我國所用的稀有鮈鯽實驗魚,多是野生個體的后代,無明確繁育體系和品系背景.為了促進實驗用魚來源和種源的標準化,中國科學院水生生物研究所先后建立了稀有鮈鯽的近交系(HAN)和封閉群(Ihb:IHB)[9-12].封閉群是指在不從外部引入新個體的條件下,以非近親交配的方式至少繁殖 4代以上而得到的實驗動物群體[13].由于封閉群動物遺傳組成較接近于自然狀態下的動物群體結構,就個體而言,封閉群動物在遺傳上具有高度的雜合性;就整體而言,封閉群的遺傳特性又保持相對穩定,因此封閉群十分適合生態毒理學研究和毒性測試[14].對稀有鮈鯽封閉群的生物學及遺傳質量監測表明,封閉群與野生種群在形態特征、臟器系數以及生長和繁殖指標上均無明顯差異,且保持了野生群體的遺傳多樣性,各代間遺傳特性也比較穩定[12].然而關于稀有鮈鯽封閉群對化學品的敏感性還缺乏研究,該群體是否可作為化學品測試的種源尚需實驗驗證.本文選擇重鉻酸鉀、五氯酚、氯化汞、對氯苯胺、氯化鎘等幾種常見的具有危害性的化學品進行毒性測試,以此來評價IHB應用于毒性測試的敏感性和適宜性,為促進稀有鮈鯽毒性測試技術體系的標準化及應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 受試生物

稀有鮈鯽野生群(WG)于2011年10月采自四川漢源縣,體長為(26.5±2.3)mm,體重(0.292±0.02)g,實驗前在室內馴養 2周以上.封閉群稀有鮈鯽為中國科學院水生生物研究所培養的 IHB第 6 代個體,體長(25.7±1.9)mm,體重(0.267±0.01)g;用于 7d亞慢性毒性測試和胚胎-卵黃囊吸收階段試驗的受精卵和仔魚均來自該封閉群.

1.2 實驗用水及化學藥品

實驗中所用稀釋水采用分析純和去離子水配制,總硬度為(250.4±20)mg/L,以 CaCO3計(GB 7477-87).重鉻酸鉀(K2Cr2O4,基準工作試劑,99.95%～100.05%,中國國藥上海化學試劑公司),儲備液濃度10g/L,濃度以Cr6+計.五氯酚(PCP,分析純,＞99%,美國 Sigma公司),用二甲基亞砜(DMSO)配制成10.0g/L,現配現用.氯化汞(HgCl2,分析純,≥99.5%,貴州省銅仁市云場坪化工礦產經營部),儲備液濃度 1.0g/L,濃度以 Hg2+計.對氯苯胺(ClC6H4NH2,分析純,98%,ACROS ORCANICS 公司),儲備液用丙酮配制成 1.0g/L.氯化鎘(Cadmium Chloride,CdCl2,分析純,100%,ACROS ORCANICS 公司),儲備液濃度10.0g/L,濃度以Cd2+計.

1.3 實驗控制條件

急性毒性試驗容器為 20cm×20cm×20cm規格的無縫玻璃缸,實測承載量約 0.5g/L.亞慢性毒性試驗容器為直徑 12cm 的玻璃結晶皿,容積約500mL.試驗容器均浸泡在水浴中,實測溫度為(25.2±0.20)℃;試驗期間光暗周期 12h:12h;試驗水體溶氧為 7.02～7.85mg/L, pH 7.35～8.19.

1.4 實驗方法

1.4.1 96h急性毒性測試 參考《化學品測試方法》[15],通過觀察實驗過程中受試魚的反應和死亡情況等,分析稀有鮈鯽對幾種常見化學品的敏感程度.實驗前將受試魚置于實驗相同條件下暫養7d,暫養期間每天投喂2次,實驗前1d停止投喂,實驗期間不投喂.實驗開始按低濃度到高濃度的順序隨機并快速的將受試魚轉入實驗缸,轉移過程在15min以內,初放入30min內持續觀察,其后每1h觀察一次,12h后根據受試魚的實際反應情況適當延長觀察時間間隔.每隔 24h按低濃度到高濃度順序更換一半實驗液,更換前后測定pH值、溶氧等水質指標.記錄實驗期間不同藥物濃度下實驗魚的異常反應、死亡情況、水質變化等,并及時撈出死亡個體.

通過預實驗確定受試魚全部死亡的最低濃度和全部存活的最高濃度,以此來設置正式實驗濃度范圍,按幾何級數設置試驗濃度組(表 1).為了進行直觀比較,野生群和封閉群對比實驗采用相同的濃度梯度;由于野生個體數量有限,故未對其開展 Cd2+和對氯苯胺急性毒性試驗.預實驗規模為5尾/缸,不設平行組;每個實驗容器盛放實驗液5L,正式實驗10尾/缸.每個濃度設置3個平行,并設空白對照.其中五氯酚實驗增加助溶劑DMSO對照組,各組用DMSO配平使助溶劑一致,實驗液中最終助溶劑添加量為0.015mL/L.

表1 96h急性毒性測試濃度梯度Table 1 The concentration gradient of 96h acute toxicity test

1.4.2 胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試 參照《化學品測試方法》和OECD魚類胚胎-卵黃囊吸收階段的短期暴露試驗方法進行[15-16].解剖鏡下觀察胚胎早期發育,取受精成功 8h(約原腸胚期)的胚胎進行實驗.對氯苯胺濃度組分別為1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0mg/L及對照組, Cd2+濃度組分別為0.05,0.10,0.20,0.40,0.80mg/L及對照組,同一濃度設3個平行.每個結晶皿盛放400mL實驗液,隨機放入30枚受精卵,每24h更換一次實驗液.觀察記錄各實驗容器中的死亡受精卵和仔魚數及仔魚的畸形情況,并及時挑出死亡個體.實驗進行到某一濃度組卵黃囊被完全吸收時結束,實驗周期 7～8d,實驗期間不投喂.實驗結束時存活個體用100mg/L的MS-222麻醉后測量體長,記錄畸形情況;安樂死后的仔魚在104 ℃下6h烘干后用1/105g電子天平稱量干重.

1.4.3 7d亞慢性毒性測試 參照 USEPA黑頭軟口鰷7d亞慢性毒性試驗[17]及有關稀有鮈鯽的亞慢性毒性試驗文獻進行[3,13].實驗用魚為孵化后1d表現正常的仔魚,一次實驗采用同對親魚所產的同批魚卵孵化的仔魚.實驗所用換水方法及實驗濃度設計與胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試相同.每個實驗容器盛放受試仔魚 15尾,每天投喂2次豐年蟲無節幼體,投喂30min后清除殘餌,將死魚挑出并作記錄,實驗持續 7d,實驗結束前12h停止投喂,將各試驗容器存活個體麻醉,在解剖鏡下測量體長;安死后的仔魚在104 ℃下6h烘干后用1/105g電子天平稱量干重.

1.5 數據分析

實驗所得數據采用SPSS16.0軟件進行分析,主要得出24,48,72,96h的半致死濃度及95%置信區間等,采用經驗公式推算安全濃度,SC=0.1×96h LC50,通過t檢驗比較不同化學品對不同來源稀有鮈鯽半致死濃度的差異性.采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett’S多重比較得出各組孵化率、仔魚畸形率、累計死亡率、體長和體重的差異等.數據分析中所用濃度為設置濃度.

2 結果

2.1 急性毒性測試

2.1.1 中毒表現 急性毒性試驗的對照組均未發現死亡和行為異常的情況,某些暴露組中的實驗魚出現了明顯的中毒癥狀.重鉻酸鉀暴露時魚體出現了浮游水面、呼吸急促等類似浮頭的現象,其后魚動作遲緩,身體逐漸失去平衡,各鰭從端部向根部漸漸潰爛、甚至脫落.五氯酚、對氯苯胺、氯化汞和氯化鎘暴露時的中毒表現與此類似,所不同的是實驗魚死亡時,身體有不同程度的彎曲,頜及鰓蓋多呈張開狀態,鰭基部有充血現象等.

將急性毒性測試后的存活個體放入標準稀釋水中飼喂觀察7d,其中重鉻酸鉀實驗中出現明顯中毒癥狀的個體在 7d內基本死亡,損傷無法恢復;未出現死亡情況的低濃度組個體基本存活,但活動能力較對照組弱.氯化汞實驗高濃度組的存活個體有部分死亡,少量存活,低濃度組存活個體基本存活.PCP實驗各個濃度的存活個體在放入標準稀釋水中飼喂后基本能存活,且活動狀態良好.

2.1.2 反應時間 稀有鮈鯽對不同藥物的反應時間有所不同,封閉群和野生群對同一種藥物的反應時間也有所不同.在不同濃度 PCP暴露下,野生群和封閉群受試個體死亡基本都發生在實驗開始 48h內;而對于重鉻酸鉀和氯化汞,在8～96h內均有個體死亡的情況發生(表2).

表2 稀有鮈鯽野生群和封閉群對3種化學品的急性毒性反應時間(h)Table 2 The response time of wild group and Ihb:IHB under different chemicals in 96h acute toxicity test (h)

2.1.3 效應濃度 由于實測濃度在設置濃度的 90%～110%范圍內,因此直接按設置濃度計算LC50和SC(表3).稀有鮈鯽對5種化學品的敏感性從高到低的順序為Hg2+＞ PCP ＞ Cd2+＞ 對氯苯胺 ＞ Cr6+.對比野生群和封閉群在同一濃度梯度下不同時間的半致死濃度,只有重鉻酸鉀暴露下有所差異(P＜0.05),Hg2+和 PCP無明顯差異(P＞0.05).總體看來,稀有鮈鯽封閉群對上述 3種化學藥品的敏感性不亞于野生群(表 3).

表3 稀有鮈鯽野生群和封閉群對幾種化學品的半致死濃度及95%置信區間Table 3 The LC50 and 95% confidence interval of acute toxicity test on wild group and Ihb:IHB respectively

2.2 胚胎-卵黃吸收階段及7d亞慢性毒性測試

2.2.1 中毒表現 對氯苯胺實驗中胚胎時期出現胚胎發育遲緩、仔魚畸形等情況.畸形仔魚的表現有:脊柱彎曲、卵黃囊吸收延遲鰾充氣延遲或鰾不充氣、圍心腔水腫、難以自由游動,活動能力差等.氯化鎘對稀有鮈鯽胚胎和仔魚產生致畸和致死作用,畸形主要表現與對氯苯胺實驗相似,如脊柱C形或S形彎曲等.

2.2.2 毒性效應 胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試中,從仔魚畸形率看,對氯苯胺1.0～4.0mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,8.0,16.0和32.0mg/L濃度組與對照組差異顯著.隨濃度升高,仔魚的畸形率會明顯上升,由畸形率確定的最低無抑制濃度(NOEC)、最低有影響濃度(LOEC)和最大容許濃度(MATC)分別為 4.0,8.0和 5.66mg/L.從實驗結束時仔魚的平均體長和平均體重來看,1.0和2.0mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,4.0mg/L濃度組開始與對照組之間差異顯著,由此確定的NOEC、LOEC和MATC分別為2.0,4.0,2.83mg/L(表4).7d亞慢性毒性測試中,從死亡率情況來看,1.0～8.0mg/L濃度組與對照組之間無顯著性差異,16.0,32.0mg/L濃度組與對照組之間差異顯著.從試驗結束時仔魚的平均體長和干重的情況來看,1.0～4.0mg/L濃度組與對照組之間無顯著性差異,8.0～32.0mg/L濃度組與對照組之間差異顯著(表5),隨著對氯苯胺濃度的增加,稀有鮈鯽仔魚的死亡率增大,生長也受到非常明顯的影響.由死亡率確定的NOEC、LOEC和MATC分別為 8.0,16.0,11.31mg/L,由仔魚的平均體長和平均體重確定的NOEC、LOEC和MATC分別為4,8,5.66mg/L.

表4 對氯苯胺和氯化鎘對封閉群稀有鮈鯽胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試結果Table 4 Effect of p-Chloroaniline and CdCl2on hatching rate, abnormality rate, mortality and growth of G.rarus

表5 對氯苯胺和氯化鎘對封閉群稀有鮈鯽的7d亞慢性毒性影響Table 5 Effects of p-Chloroaniline and CdCl2 on mortality and growth under 7-day subchronic toxicity test on larvae

當胚胎-卵黃囊吸收階段暴露于不同濃度的氯化鎘時,孵化率在0.05mg/L濃度組與對照組間無顯著性差異(P＞0.05),0.10mg/L濃度組開始與對照組差異顯著;當濃度為0.05mg/L和0.1mg/L時仔魚畸形率與對照組無顯著性差異,0.20～0.80mg/L濃度組與對照組之間存在顯著差異,從實驗結束時仔魚的平均體長和平均體重來看,0.05和0.10mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,0.20mg/L濃度組開始與對照組之間差異顯(表4);由畸形率和生長確定NOEC、LOEC和MATC均為0.10,0.20,0.14mg/L;7d亞慢性測試中,由0.2mg/L濃度組開始至0.8mg/L濃度組仔魚的平均體長和干重與對照組有顯著性的差異,隨著鎘離子濃度的升高,仔魚的生長受到很明顯的影響(表 5),由此推算的NOEC、LOEC和 MATC分別為 0.10,0.20,0.14mg/L.

3 討論

3.1 急性毒性測試

結果表明,封閉群稀有鮈鯽對幾種化學品參比物的敏感性不亞于其他常見實驗魚種[2,18-22].將本實驗結果與2006年重鉻酸鉀和五氯酚對稀有鮈鯽毒性測試數據進行比較發現,其半致死濃度與本試驗結果沒有明顯差異.2006年進行重鉻酸鉀和五氯酚的急性毒性測試的受試魚為實驗室繁育的普通后代(圖1),說明稀有鮈鯽封閉群作為受試魚進行毒性測試的敏感性較高且穩定,并有著有良好的重復性和可操作性.

圖1 2011年野生群和封閉群與2006年野生群后代對重鉻酸鉀和五氯酚96h半致死濃度對比Fig.1 The 96h LC50of wild group, Ihb:IHB and offspring of wild group respectively in 2011and 2006 on Cr6+and PCP

20世紀 70年代關于金魚和黑頭軟口鰷對PCP的急性毒性試驗表示,在一定范圍內,不同年齡、不同規格受試魚的半致死濃度相差不大[23].在本實驗中,稀有鮈鯽也存在相似情況,野生群個體大小差異相對較大,日齡不確定,在同一個暴露濃度下,死亡情況隨機發生,與受試魚個體大小沒有明顯關系.周永欣等[4]對 2～24d稀有鮈鯽進行急性毒性測試顯示,2,12,24日齡稀有鮈鯽對PCP的 96h LC50分別為 103.3,70.1,113.2μg/L;對 30日齡,體長為(9.5±2)mm的稀有鮈鯽進行PCP的96h毒性測試得到 LC50為 81μg/L[21],對超過 2月齡體長為(20±3)mm的稀有鮈鯽96h LC50為101.5μg/L[18],本研究野生群受試魚體長為(26.5±2.3)mm,封閉群受試魚體長為(25.7±1.9)mm(均大于 2月齡),對 PCP的 96h LC50分別為 105.6,111.5μg/L.總體看來,不同日齡和不同個體大小的稀有鮈鯽對PCP的敏感性存在一定差異,但對于30日齡以上的實驗魚,LC50的差異并不大.

事實上,在化學品測試的應用中,除了敏感性外,可重復性和可操作性也是測試技術體系需要關注的問題.已有研究表明,稀有鮈鯽的早期發育大致需要1個月左右,在這期間,仔魚的器官逐漸發育,化學品可能對某些階段的發育影響較大[24],當使用30日齡以下的仔魚進行實驗時,不同大小(日齡)的個體處于不同的發育期,容易導致結果的差異.而 1～3月齡的稀有鮈鯽,除了性腺之外,各器官均已發育完成,對化學品的敏感性相對穩定,適合用于毒性測試.考慮到在飼養、運輸以及實驗操作等方面的便利性,作者建議采用全長(30±10)mm(相應的體長為24mm左右)的魚作為96h急性毒性測試用魚.

3.2 胚胎-卵黃囊吸收階段及 7d亞慢性毒性測試

胚胎-卵黃囊吸收階段和 7d亞慢性毒性測試都屬于短期暴露試驗(表6),以魚類的早期生活史階段為材料,觀測致死和亞致死毒性效應.對于稀有鮈鯽而言,這2個試驗試驗周期相近,但試驗魚所處的發育期不盡相同,因而在可操作性、觀測指標等方面有一些差異.胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試以卵黃囊吸盡為終點,通常包括胚胎期 3d和卵黃囊仔魚期 4d,試驗的觀測指標主要包括孵化率,畸形率、死亡率、平均體長和干重等.7d亞慢性毒性測試的實驗起點為初孵不久的仔魚,試驗周期 7d,實際包括卵黃囊仔魚期 3～4d以及晚期仔魚3～4d,試驗周期內仔魚由內源性營養轉為外源性營養,成功攝食是仔魚進一步發育和存活的關鍵[24-25].7d亞慢性毒性測試的觀測指標主要包括死亡率、平均體長和干重等.胚胎期可能對有毒物質十分敏感,但是在亞慢性毒性測試中,其毒性效應不一定能從孵化率、胚胎畸形率等表觀指標上反映出來.本研究的結果表明,除對 Cd2+的試驗中孵化率指標較為敏感外,其余試驗中均以生長指標(平均體長和干重)最為敏感,且2種亞慢性毒性測試的靈敏度相當.此外,從本文的結果以及文獻數據來看[18,26-27],生長指標的靈敏度要高于死亡率指標,而平均體長和干重所確定的效應濃度基本相同.本研究表明,體長指標是稀有鮈鯽亞慢性試驗中最方便的觀測指標,與胡煒等[26]研究結果一致.

從實驗的操作性來看,胚胎卵黃囊吸收階段試驗的起點為受精卵,一般在受精后8h內即開始試驗,通常需要實驗室專門飼養親魚才能進行該試驗,對于小型實驗室而言,實驗存在成本和技術上的難題;而且,由于稀有鮈鯽卵具有較強的粘性,在分組等操作時既費時又容易導致受精卵損傷,從而影響實驗結果.7d亞慢性毒性測試一般從孵出后 24h內開始實驗,受精卵或仔魚可以從繁育中心運抵實驗室,因而材料獲取上更為廣泛.與胚胎卵黃囊吸收階段試驗相比,7d亞慢性毒性測試需正常飼養的方式投喂豐年蟲幼體,在豐年蟲卵的來源與保存、孵化方法、投喂操作等方面沒有制約性的困難.因為投喂了食物,對照組或未受到毒性影響的仔魚生長較快,從生長指標上觀測毒性效應更為方便;同時,仔魚的攝食率也可能成為潛在的觀測指標.目前,在《化學品測試方法》以及已經頒布的有關化學品生態毒理學測試標準中考慮了胚胎卵黃囊吸收階段試驗,但未納入7d亞慢性毒性試驗,因此,后者更具有可操作性和推廣前景,應加強稀有鮈鯽亞慢性毒性試驗方法的優化,制定相關的技術規范和標準.

表6 胚胎-卵黃囊吸收階段和7d亞慢性毒性測試的比較Table 6 The comparison of short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages and 7-day standard reference toxicant test

4 結論

4.1 急性毒性試驗結果表明,稀有鮈鯽封閉群(IHB)對Hg2+、五氯酚、 Cd2+、對氯苯胺和Cr6+等化學品敏感,對Hg2+、PCP和Cr6+的敏感性不亞于野生群體.對 PCP、Cr6+的實驗結果重現性較好.

4.2 胚胎-卵黃囊吸收階段和7d亞慢性毒性測試結果表明,Cd2+和對氯苯胺暴露后封閉群在孵化率、畸形率、死亡率、生長等方面均表現出毒性效應,其中體長生長指標較敏感并方便觀察.兩種試驗的靈敏度相近,7d亞慢性毒性測試更具有可操作性和推廣前景.

4.3 稀有鮈鯽封閉群 IHB適合于作為化學品生態毒理學測試的種源.使用封閉群作為測試生物,有助于在種源、種質、繁育及供應等方面促進稀有鮈鯽毒性測試技術體系的標準化,提高測試質量.

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