胰腺癌患者血清代謝組學研究

楊鳴 錢維 董昕 楊帆 朱偉 張永鎮 李兆申 蔡全才

胰腺癌患者一旦確診多已進入晚期轉移階段[1]，因此提高胰腺癌早期診斷的效率是改善預后的關鍵。然而目前應用于臨床的胰腺癌診斷方法在敏感性和特異性方面還存在相當局限性[2-4]。腫瘤發生、發展的病理變化造成機體基礎代謝產生相應變改，最終造成與正常個體之間代謝譜的差異[5]。代謝產物作為新的生物學標志物，也許是一種有效的腫瘤早期診斷的工具[6]。本研究應用代謝組學技術分析胰腺癌與正常人血清間的差異代謝物，尋找可以作為胰腺癌早期診斷的特異性標志物。

材料和方法

一、研究對象

本研究設計采用病例對照成組分析方法，以病理診斷為胰腺導管腺癌患者作為病例組，健康人群為對照組。胰腺癌患者為2013年6月到2013年10月長海醫院肝膽胰脾外科住院患者。納入標準：(1)同意參加本課題研究；(2)必須為初診病例；(3)經病理診斷為胰腺導管腺癌；(4)能獲得治療前空腹靜脈血標本；(5)能調查獲得有關暴露信息；(6)年齡≥35歲；(7)漢族。排除標準：(1)有其他腫瘤、高血壓、冠心病、肝硬化、腎功能不全、代謝性疾病、血液病等；(2)過去2周內使用過抗生素、激素、非甾體消炎藥等；(3)過去2周內有重大應激反應，采血前接受過放療、化療者；(4)6個月內有輸血史。對照組為長海醫院體檢中心體檢健康的人群。

二、血清代謝組學檢測

取患者入院后治療前和對照組人群晨起空腹靜脈血2 ml，30 min內離心分離血清。取100 μl血清，加300 μl甲醇和乙腈混合溶液(V∶V=2∶1)混勻，置4℃ 10 min， 4℃ 13 000 r/min離心15 min，取上清液4 μl上高效液相色譜單級四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀(UHPLC/Q-TOF MS)。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC@HSS T3(1.8 μm， 100 mm×2.1 mm)。先用含5%乙腈的0.1%甲酸平衡柱子，上樣后繼續用該液洗脫2 min，然后用含95%乙腈的0.1甲酸分別洗脫17、19 min，流速0.4 ml/min，壓限值800 bar(壓強單位，1 bar=105Pa)，柱溫40℃。電噴霧離子源頭為正、負離子檢測模式(正離子ESI+，負離子ESI-)。正離子模式：干燥溫度350°C，氣體流量1 L/min，霧化器45 psi(磅/英寸2)，毛細管電壓4 000 V，裂解電壓120 V，分離機電壓160 V，八級桿RF峰電壓750 V，參照質量121.0509 m/z、922.0098 m/z；負離子模式：干燥溫度350°C，氣體流量1 L/min，霧化器45 psi，毛細管電壓3 000 V，裂解電壓120 V，分離機電壓160 V，八級桿RF峰電壓750 V，參照質量112.985587 m/z、1033.988109 m/z。

將所有對照人群的血清混合，制備為質控樣品(QC)。在進行序列分析之前，連續進樣6次QC，以確定系統的重復性。在序列分析中，每隔9個樣品進樣一次QC，以確定系統的穩定性。通過將QC的質譜總離子流色譜圖(TIC)重疊，直觀地判斷儀器在分析樣本時的穩定性和重復性。

三、數據提取及預處理

在R軟件平臺下采用XCMS程序代碼提取原始數據信號(峰識別和積分)，然后進行保留時間校正、峰對齊和反卷積分析(質譜碎片歸屬)，最后在EXCEL軟件中進行后期編輯。將結果組織為二維數據矩陣，包括變量(保留時間RT，質荷比m/z)、觀察量(樣本)和峰值強度，并且對所有原始數據進行歸一化處理。將編輯后的數據矩陣導入Simca-P軟件(11.0版本)，進行多變量數據分析。

多變量數據分析首先采用主成分分析(principal componem analysis, PCA)模型，即無監督模式識別，以觀察各組樣本之間的總體分布，進行數據的聚類及去除離群樣本，確定儀器穩定性。然后用偏最小二乘方判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)模型，即有監督模式識別，返回各變量的變量權重(variable importance on projection，VIP)值。VIP值>1.0被認為變量對該模型有較大影響。為了獲取差異更加明顯的變量，本研究只選擇了VIP值>1.5的變量[7]。每個PLS-DA模型都生成一個S-plot可視化載荷圖，對模型影響程度越大的變量，其協方差和相關系數越大。為防止PLS-DA模型的過度擬合，采用7次循環交互驗證和200次響應排序檢驗方法來評估模型質量。

四、差異代謝物篩選及鑒定

選擇VIP值>1.5，并在S-plot中具有較大相關性和協方差的變量篩選有統計學意義的變量。通過將這些差異代謝物的m/z與網絡數據庫，如數據庫HMDB (http://www.hmdb.ca)、METLIN (http://metlin.scripps.edu)和 KEGG (http://www.kegg.jp)等進行比對，初步確認差異物的分子質量和結構式，然后根據得到的分子式以及質譜/質譜(MS/MS)裂解譜圖，再與數據庫比對以進一步確定其結構，最后還要根據標準品的RT、m/z及MS/MS結果確定差異代謝物。

五、統計學處理

結 果

一、入選研究對象

共納入胰腺導管腺癌患者及健康者108例。為減小由疾病本身以外的因素引起的代謝誤差，兩組以1∶1配對，各54例，年齡±3歲、性別相匹配。胰腺癌組及健康對照組男∶女比例均為39∶15，胰腺癌組年齡平均為(57±7)歲,健康對照組為(58±7)歲。

二、系統的穩定性

儀器檢測所得到的正、負離子的總離子流圖的重合圖見圖1。譜峰重疊良好，表明系統的重復性及穩定性均符合實驗要求，數據比較可靠。

三、PCA模型結果

正離子模式下，兩個相互正交的主成分PC1和PC2能夠體現原始數據集中的70.7%(解釋率R2=0.707)和預測原始數據集中的29.0%的方差(預測率Q2=0.29)。負離子模式下兩個相互正交的主成分PC1和PC2能夠體現原始數據集中的60.1%(R2=0.601)和預測原始數據集中的42.8%的方差(Q2=0.428)。兩個離子模式數據建立的PCA模型的解釋率均較好(R2均>0.5)，但預測率的效能較差。

圖1 QC在正(a)、負(b)離子模式下的總離子流圖重合圖

四、PLS-DA模型結果

正離子模式下R2=0.941，Q2=0.861；負離子模式下R2=0.93，Q2=0.824，說明PLS-DA正、負離子兩模式的解釋率及預測率均較高(均>0.5)，兩組樣本分別在不同區域，相對集中(圖2)。相應排序檢驗(RPT)結果示正、負離子模式Q2回歸直線與Y軸的截距均小于0(正離子模式Q2截距為-0.117，負離子模式為-0.0825)，說明兩PLS-DA模型可靠。

a:正離子模式；b:負離子模式

五、潛在代謝標志物的篩選

胰腺癌與健康者的血清經篩選后共有12種差異代謝物(表1)。其中羥基花生四烯酸(HETE)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、乙酰肉堿(Acetylcar-nitine)、亞油酸(Linoleic acid)、棕櫚酰肉堿(Palmitoylcarnitine)、亞油醇肉堿(Linoleyl carnitine)、尿嘧啶脫氧核苷酸(dUMP)和甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholic acid 3-glucuronide)8種代謝產物在胰腺癌患者血清中水平高于正常人群(t或z值分別為7.76、6.99、3.64、2.43、5.89、5.41、6.51、4.6，P值均<0.05)，溶血磷脂酰膽堿[LysoPC(18∶0)]、LysoPC(P-16:0)、溶血磷脂酸[LPA(18∶2/0∶0)]、LysoPC(14∶0)4種代謝產物在胰腺癌患者血清中水平低于正常人群(t或z值分別為13.3、6.96、6.45、5.48，P值均<0.05)。HETE、LysoPC(18∶0)、Phenylalanine、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP的AUC值均高于CA19-9的AUC值0.90(表2)。

討 論

近來一些胰腺癌血清代謝組學研究發現，依據血清差異代謝物建立的胰腺癌診斷模型區分力及準確度都很高[8-9]。以一系列血清氨基酸組合作為診斷模型，其對胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群鑒別診斷價值高，ROC曲線下體積(volume under ROC surface，VUS)達到0.891(95%CI0.794～0.968)，甚至超過CA19-9[9]。Kobayashi等[8]的研究發現，以血清木糖醇、1,5-脫水-D-葡萄糖醇、組氨酸和肌醇組合對胰腺癌和正常人群鑒別診斷的敏感度和特異度可以分別達到86.0%和88.1%。

表1 胰腺癌患者和健康者血清的差異代謝物

表2 胰腺癌患者和健康者血清差異代謝物峰值強度及AUC(95%CI)

本研究應用UHPLC/Q-TOF MS為基礎的代謝組學技術檢測胰腺癌、正常人群血清間的代謝組差異，篩選出12種有統計學意義的差異血清代謝物，其中5個差異血清代謝產物[HETE、LysoPC(18∶0)、苯丙氨酸、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP]的AUC大于CA19-9的AUC。

本研究發現胰腺癌患者血清LysoPC較健康人群顯著下降，特別是LysoPC(18∶0)和LysoPC(P-16∶0)的下降更顯著。與之前報道的胰腺癌[10-11]及其他惡性腫瘤，如肝癌[12]、腎細胞癌[13]等代謝組學研究結果相似。LysoPCs通過磷脂酰膽堿經磷脂酶A2水解形成，同時LysoPCs在溶血磷脂酶D的作用下水解生成溶血磷脂酸(LPA)。LysoPCs和LPA在細胞增殖、腫瘤細胞的侵襲和炎癥反應等生理病理過程中發揮重要作用[14]。Fang等[10]發現，大鼠胰腺癌組織磷脂酰膽堿和甘油磷酸膽堿水平比正常胰腺組織降低，原因可能是膽堿酶和磷酸膽堿轉移酶被抑制和(或)磷酸膽堿經由胞苷二磷膽堿代謝途徑大量消耗所致[15-16]。胰腺癌患者血清LysoPCs和LPA的降低有可能是惡性腫瘤致患者炎性反應激活而導致本身PC水平降低或磷脂酶A2、溶血磷脂酶D活性的抑制所引起[17]。

本研究結果表明，乙酰肉堿、棕櫚酰肉堿、亞油醇肉堿3種肉堿類代謝產物及亞油酸在胰腺癌患者血清的水平顯著升高。肉堿在細胞中主要通過參與3條脂質代謝通路發揮維持細胞正常狀態的功能，分別是促進長鏈脂肪酸進入線粒體，幫助除去短鏈和中鏈脂肪酸以及維持膜磷脂的循環更新[18]。脂肪酸在氧供給充足的條件下經β-氧化產生能量。胰腺癌患者血清中這些脂質生物成分的升高可能是由于細胞膜合成和細胞增殖活動的增強導致的能量需求增加[19]。酰基肉堿在游離脂肪酸氧化過程中起關鍵作用，它負責將乙酰輔酶A運送至線粒體內。胰腺癌患者血清酰基肉堿的升高可能由于胰腺癌患者線粒體內脂肪酸β-氧化活動的上調[19]。

HETE在胰腺癌患者血清中低于正常人血清，區分兩者的AUC均達到98%，與Urayama等[20]的研究結果相同。HETE是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在脂加氧酶(lipoxygenase，LOXs)的催化下形成的，它進一步轉化為白三烯。近來大量研究結果表明，AA代謝終產物與腫瘤的病理形成和發展有密切的關系，LOX在胰腺癌中高表達，其中5-HETE與12-HETE通過激活P44/22有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3/AKT激酶途徑可促進胰腺癌細胞內DNA合成[21-23]。

本研究結果還顯示， HETE、LysoPC(18∶0)、苯丙氨酸、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP的AUC均大于CA19-9，提示這些差異代謝物是潛在的診斷標志，可能在胰腺癌發生、發展中有重要的生物學意義。本研究結果需要在更多的人群中進一步驗證它們作為診斷標志物的價值。

參 考 文 獻

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