胰腺癌循環微小核糖核酸載體的研究

馮慧 王亞雷 陳熹 張辰宇 袁耀宗 姚瑋艷

近年來微小核糖核酸(microRNA, miRNA)在腫瘤的診斷和治療中的作用越來越受到關注，其中循環miRNA的發現為胰腺癌的早期診斷提供了極大的契機，同時也為研究胰腺癌發生、發展的可能分子機制提供了全新的思路和途徑。但是在胰腺癌中，循環miRNA是如何產生、如何穩定存在的，其生物學功能又是什么，這一系列的問題還有待闡明。本研究采用梯度離心法分離人胰腺癌細胞系培養上清、健康人群和胰腺癌患者血清中的微囊泡(microvesicle，MV)，了解細胞培養上清及血清中的MV是否包含循環的miRNA，探討循環miRNA的載體。

材料和方法

一、血清MV的分離

采集6例病理證實的尚未行手術治療、放療及化療的胰腺導管腺癌患者外周血，以6例同年齡段健康體檢者的外周血作為對照組。加入3.8%的檸檬酸鈉溶液抗凝后上下混勻，室溫1 000 r/min離心10 min后取上層血漿，然后4℃ 300 g/min離心5 min去除殘留血細胞，4℃ 1 500 g/min離心20 min去除血小板及其他細胞碎片，4℃ 3 000 g/min離心30 min去除殘存細胞器，最后4℃ 110 000 g/min離心70 min棄上清，沉淀即為血清的MV。用500 μl PBS反復吹打溶解后置4℃保存。同時將含有游離miRNA的上清4℃保存。

二、細胞培養上清的MV分離

胰腺癌SW1990、BxPC3細胞系由上海交通大學附屬瑞金醫院內科實驗室饋贈，常規培養，每2～3 d傳代。收集細胞培養液，室溫1 000 r/min離心5 min后取上清，然后4℃ 3 000 g/min離心30 min，4℃ 110 000 g/min離心70 min棄上清，沉淀即為細胞培養上清的MV。用500 μl PBS反復吹打溶解后置4℃保存。

三、miRNA水平檢測

采用酸性酚法提取血清miRNA，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞培養上清和血清MV中miRNA。應用實時PCR法檢測miRNA水平。PCR反應體系：Taq酶0.33 μl，cDNA 1 μl，MgCl21.2 μl，dNTP mixture(2.5 mmol/L) 1.6 μl，10×PCR buffer 2 μl， TaqMan probe+primer 1 μl，ddH2O 12.5 μl；反應條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40個循環，最后60℃延伸5 min。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-ΔΔCt計算miRNA的水平。

四、MV的Ago2、CD63蛋白水平檢測

分離的血清MV直接用裂解液裂解，細胞培養上清MV用預冷的PBS洗滌2次后加入預冷的裂解緩沖液冰上裂解30 min，其間用槍吹打幾次，12 000 g離心15 min取上清，BCA法定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex、RISC)的核心元件Ago2蛋白及MV的標志性糖蛋白CD63的水平。兔抗人Ago2、CD63抗體購自Abcam公司，工作濃度分別為1∶200及1∶400，羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，工作濃度1∶1 500。最后ECL發光，X線曝光、顯影、定影。

五、統計學處理

結 果

一、胰腺癌細胞和培養上清MV的Ago2、CD63蛋白表達水平

為了解所離心物質是否為MV，本研究檢測胰腺癌細胞及其培養上清MV的Ago2、CD63蛋白。結果它們均表達Ago2、CD63蛋白(圖1)。

圖1 SW1990、 BxPC3(1、3)細胞及其培養上清MV(2、4)的Ago2、CD63蛋白表達

二、SW1990、 BxPC3培養上清MV包裹的和游離的(MV-free)miRNA水平

參考文獻[1-2]，本研究檢測胰腺癌患者血清中顯著升高的10個miRNA水平。兩株細胞培養上清中均存在MV包裹的miRNA及游離的miRNA，但其含量存在較大差異(圖2)。

圖2 SW1990(a)、BxPC3(b) 培養上清MV內包裹的和游離的miRNA表達量

三、胰腺癌患者血清MV包裹的和游離的miRNA水平

選擇6個在胰腺癌患者血清中含量相對較高的miRNAs(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-191、miR-483-5p)進行研究[1-2]。胰腺癌組、對照組的血清及MV中均存在miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-191、miR-483-5p(圖3)，但以MV包裹的量較多，且胰腺癌組MV包裹的miRNA量與對照組不完全一致，miR-20a、miR-24、miR-191分別為對照組的(2.93±0.29)、(2.73±0.46)、(2.39±0.51)倍，差異有統計學意義(F值分別為75.97、25.80、12.94，P<0.05或<0.01，圖4)。

圖3 對照組(NC)和胰腺癌患者(PDAC)血清中miRNA的水平

圖4 對照組(NC)和胰腺癌患者(PDAC)血清中MV包裹的和游離的(MV-free)miRNA含量

討 論

近年來研究發現miRNAs與腫瘤的發生、發展關系密切。miRNAs是19～25個核苷酸、非蛋白質編碼的小RNA家族，通過與靶miRNA3′端的非編碼區結合，降解或者抑制mRNA的翻譯，導致靶基因轉錄后沉默，從而參與靶基因功能的調節。癌相關性miRNA可以在腫瘤患者的周圍循環中檢測到。國內外研究發現，在食道癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]、彌漫性B細胞淋巴瘤[6]、前列腺癌[7]等疾病中，循環miRNA可作為臨床診斷和預后評估的分子標志物。Liu等[1]通過對血清和組織中的miRNA比較，得出血清中的miRNA來源于腫瘤細胞，并發現7種miRNA(miRNA20a、miRNA21、miRNA 24、miRNA 25、miRNA 99a、miRNA 185、miRNA 191)聯合檢測可以區別胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常健康者，且這7種miRNA在早期病變時就有變化。在26例Ⅰ期胰腺癌患者中，聯合診斷率為96.2%，在48例Ⅱ期胰腺癌患者中，聯合診斷率達91.7%。

MV是機體內細胞在正常和病理狀態下都會分泌的直徑在30～1 000 nm之間的膜結構小體，包括exosome和shedding vesicle兩種[8-9]。紅細胞、B細胞、T細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等多種細胞均能分泌MV。細胞把特異的生物活性分子如蛋白質等包裹到MV中，這些生物活性分子通過MV被運輸到相應的受體細胞并調節受體細胞的生物功能，這種由MV介導的細胞間信息傳遞在一些生理和病理過程中起著十分重要的作用[8-9]。

Ogawa等[10]應用miRNA芯片分析技術發現源自脂肪細胞的MV中也富含大量的miRNA，同時脂肪細胞分泌的miRNA會調控其靶細胞巨噬細胞的成熟和分化。Collino等[11]發現造血干細胞分泌的MV中包裹的miRNA會調控小鼠血管內皮細胞內多個與其生理過程密切相關的基因的表達。而Sun等[12]在分泌miRNA領域的后續研究發現，牛奶中富含的免疫相關miRNA會通過MV行使免疫調節功能。為了解血清中miRNA作用途徑及是否存在相應載體，他們通過梯度離心法分離血清和T淋巴細胞培養上清中的MV，發現血清及細胞培養上清中的MV包含miRNA，并且MV可能是循環miRNA的主要載體[13]。本研究通過梯度離心方法胰腺癌細胞系SW1990、BxPC3培養上清及胰腺癌患者及對照組上清中的MV，它們均含有外核體表面的標志性蛋白CD63及miRNA行使功能的蛋白Ago2，并且這些MV富含miRNA。表明MV是miRNA最主要的載體。進一步檢測胰腺癌患者和對照組血清miRNA的表達，發現miR-20a、miR-24、miR-191在胰腺癌患者血清中表達較對照組顯著升高，而且血清中的miRNA絕大部分被包裹在MV中。胰腺癌患者與對照組血清MV包裹的miRNA不同，且包裹的量也不同，有些游離的miRNA量較MV包裹的高，這可能與在不同的生理或疾病狀態下MV選擇性包裹miRNA相關。這種選擇性的包裹是細胞主動地、特異性地分泌miRNA的基礎。

參 考 文 獻

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